Средняя школа № 1 г.Лунинец Брестской области Секция ХИМИИ ВЫДЕЛЕНИЕ, АНАЛИЗ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ НЕКОТОРЫХ ЛИШАЙНИКОВ Выполнили: Боровой Михаил Романович Гопко Владислав Владимирович Балицкая Галина Александровна Громыко Александра Александровна 8 класс Научный руководитель: Учитель химии высшей категории Козлова Татьяна Васильевна Научный консультант: Доцент кафедры аналитической химии БГУ, к.х.н. Подтероб Александр Павлович ОГЛАВЛЕНИЕ Введение стр. 3 – 22 Основная часть стр. 23 – 30 Заключение стр. 31 Список литературы стр. 32 – 34 ВВЕДЕНИЕ Цель работы заключается в поиске распространённых на территории РБ видов лишайников, которые могли бы служить источниками получения антрахиноновых соединений, а также в разработке простой эффективной методики их выделения. Производные антрахинона обладают широким спектром биологической активности. Известно более 50 фитопрепаратов, в состав которых входят природные антрахиноны. Они применяются как мягкие слабительные и антидерматические средства, для лечения геморроя, язвенной болезни, хронического гастрита, мочекаменной болезни, болезни печени и других заболеваний. Для получения фитопрепаратов используют кору крушины ольховидной, плоды жостёра слабительного, корни марены красильной, листья алоэ и другие виды растительного сырья. Несмотря на применение синтетических аналогов, роль растительного сырья как источника биологически активных веществ нисколько не снижается. В связи с вышеизложенным актуален поиск новых перспективных видов растительного сырья для получения антрахинонсодержащих препаратов. Таким видом растительного сырья могут служить лишайники, которые, как известно, издавна и до настоящего времени применяются в медицине (например, цетрария исландская или « исландский мох» ). Кроме того, в некоторых странах из лишайников получают красители, закрепители запаха духов и другие ценные вещества. Естественно, что искомые лишайники должны быть достаточно распространёнными видами, а их использование должно быть рациональным и не приносить ущерба окружающей среде. Главный недостаток лишайников как источника сырья для нужд медицины заключается в их медленном росте. Однако, в последние годы достигнуты успехи в культивировании некоторых лишайниковых микобионтов( составных частей лишайникового симбиоза - грибов). Возможно, в ближайшее время станет реальным выращивание и самих лекарственных лишайников. Задачи: Для достижения поставленной цели( поиск лишайников и их анализ) необходимо решить следующие основные задачи: 1) Поскольку антрахиноны- окрашенные вещества( жёлтые, оранжевые, коричневые), то целесообразно отбирать виды с яркой окраской; 2) Из числа отобранных видов исключить редкие, исчезающие, а также малораспространенные на территории РБ; 3) По литературным данным охарактеризовать химический состав, описать строение и свойства обнаруженных в них антрахинонов; 4) Разработать простые и в то же время эффективные методики выделения суммы антрахинонов и отдельных их представителей; 5) Изучить физико-химические и другие свойства выделенных антрахинонов. Гипотеза. Предполагается, что разделение антрахинонов тесно связано с их строением и определенные структурные элементы в молекулах будут сильно влиять на их экстракционные свойства. Такими структурными элементами являются внутримолекулярные водородные связи, а также гидроксильные и карбоксильные группы. Так как в молекуле париетиновой кислоты имеется карбоксильная группа, то данную кислоту можно отделить от других антрахинонов действием водного раствора гидрокарбоната натрия на бензольный раствор смеси веществ. В молекуле другого вещества – париетина имеются лишь две гидроксильные группы, образующие внутримолекулярные водородные связи, снижающие энергию гидратации молекулы. Поэтому париетин, в отличие от других антрахинонов, должен растворяться в горячем гексане и выпадать из него при охлаждении раствора. Актуальность работы заключается в глобальном ухудшении экологической обстановки, росте численности населения и инфекционных заболеваний, в связи с чем необходим поиск новых эффективных антибиотиков, к которым у микроорганизмов еще не выработаны резистентные свойства. Новизна работы: впервые проведено экстракционное фракционирование веществ лишайника ксантория настенная с использованием гексана и бензола, а также водных растворов гидрокарбоната натрия и гидроксида натрия. Два выделенных антрахинона идентифицированы спектральным методом. Практическая значимость работы заключается в применении лишайниковых антрахинонов в качестве антидерматических и лечебно-косметических средств, а также кислотно-основных индикаторов. Лишайники представляют собой своеобразную и относительно малоизученную группу низших растений-симбионтов, у которых гриб (микобионт) в некоторой мере паразитирует на водоросли (фотобионт). В состав почти половины всех видов лишайников входит зеленая водоросль Trebouxia (Требуксия). Тело лишайника (таллом, слоевище) представляет собой рыхлый материал – гибкий каркас из тонких грибных нитей (гифов), занимающим 90 – 95 % объема слоевища, в котором по отдельности, нитями или слоями расположены водорослевые клетки [1, 2]. Лишайники издавна находят разнообразное практическое применение, в том числе как источники получения лекарственных средств [3, 4]. Наибольшее применение в медицине получил так называемый “исландский мох” или цетрария исландская (Cetraria islandica) [3, 10 – 13]. Первое упоминание об этом лишайнике как лекарственном средстве относится к 1673 г [9]. К настоящему времени накоплен достаточно обширный экспериментальный материал, касающийся химического строения, свойств [10 – 21] и биологического действия [22 – 25] многих лишайниковых веществ. В последние годы наблюдается прогресс в области культивирования лишайников и их микобионтов, открывающий возможность массового производства лишайниковых веществ для нужд фармации [10, 26 – 29]. Из лекарственных средств лишайникового происхождения необходимо отметить препараты “Бинан” (или натрия уснинат) [4, С. 57 – 62; 35, С. 429 – 430], “Эвозин” [31], “Цетрис” и некоторые другие [8]. В настоящем обзоре освещаются в основном достижения последних двух десятилетий в области исследования структуры и свойств биологически активных лишайниковых веществ и их применения, приводятся также данные об элементном химическом составе лишайников. Химические элементы Ильин В.Б. в монографии [32, С.28] приводит таблицу среднего содержания 16 химических элементов в лишайниках, составленную им по данным отечественных и зарубежных публикаций. Объем выборки для каждого элемента составлял от нескольких десятков до нескольких сотен дат. В целом, по сравнению с высшими растениями (мхи, папоротники, злаки, бобовые, лебедовые, крестоцветные, сложноцветные, гречишные), лишайники накапливают больше Fe, Zn, меньше – N, P, K, Na, Ca, Mg, S, CI, B, Mo. Примерно равные количества в лишайниках и высших растениях элементов Mn, Cu, Co. Особенностью лишайников является повышенное содержание в их золе оксида кремния. Органические вещества Двойственная природа лишайников отражается на их химическом составе. С одной стороны, присутствуют вещества, типичные для водорослей и грибов; с другой – специфические для лишайников, синтезируемые только в симбиозе водоросли и гриба, – так называемые лишайниковые кислоты. Следует отметить, что в составе свободноживущих водорослей и грибов есть существенные различия. Так, в грибах присутствуют хитин и гликоген, а в водорослях – целлюлоза и крахмал. Лишайники содержат особое вещество – лихенин, открытый Берцелиусом в 1814 г и названный им “лишайниковым крахмалом”. У некоторых видов лихенин может составлять до половины сухой массы лишайника. Содержание же белков и жиров невелико – соответственно 0.5 – 3 и 1 – 2 % [3, С. 13 – 19]. Вещества лишайников можно условно разделить на 2 группы: первичные и вторичные (схема 1). Первичные лишайниковые вещества выполняют структурную функцию и участвуют в клеточном обмене. В основном это те же вещества, что и в других растениях. Роль вторичных лишайниковых веществ окончательно не выяснена. Около 30 лет назад было известно более 250 таких веществ, из которых щ 75 – специфические лишайниковые вещества (в основном лишайниковые кислоты). Роль вторичных лишайниковых веществ окончательно не раскрыта. Более вероятно, что они являются антибиотиками (кислоты), участвуют в фотосинтезе (атранорин), действуют как светофильтры, т. е. защищают фотобионт от чрезмерной радиации (париетин), способствуют передвижению углеводов из фото- в микобионт, участвуют в разрушении минерального субстрата [2]. Лишайниковые вещества Первичные Вторичные Хитин (в оболочках гиф) Лихенин Изолихенин Гемицеллюлозы Пектины Дисахариды Полиспирты Аминокислоты Витамины Ферменты Пигменты (в хромофорах водорослей): хлорофиллы а и b, , - и - - каротины, ксантофилл и др. Обычно 0.1 – 2 % от воздушно-сухой массы, реже до О2 – 5 %: - атранорин (1.2 – 3 %) - фумарпротоцетраровая кислота (0.5 – 1.5 %) - гирофоровая кислота (1 – 4 %) - салациновая кислота (4 – 6 %) - усниновая кислота (0.2 – 4 %) - леканоровая кислота (до 36 % от сухой массы в пармелии окрашенной) и др. Схема 1. Приблизительный состав лишайниковых веществ (по данным д.б.н. Х.Х.Трасса [2, С. 423 – 425]). По данным Хунека (Германия) и Яшимуры (Япония), авторов современного руководства по идентификации лишайниковых веществ, всего в лишайниках насчитывают около 700 веществ с известной структурой [10]. Основные классы этих веществ: 1. Азотсодержащие соединения (аллантоин, артонин, артогалин, холинсульфат, солоринин и др.); 2. Фосфорсодержащие соединения (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин – Pseudevernia furfuracea (L.) Zopf); 3. Серусодержащие соединения (диметилсульфон – Cladonia deformis (L.) Hoffm.); 4. Углеводы и полиспирты; 5. Углеводороды (этилен, гептадекан и др.); 6. Алифатические кислоты (содержащие пятичленные лактонные кольца, а также стеариновая, пальмитиновая, олеиновая и др.); 7. Моноциклические ароматические соединения (атранол, бензойная кислота, диваринол и др.); 8. Хиноны (бензо-, нафто-, бис-нафто-, антра-, бис-антра-, бифенил-, терпенил-, фенантрен-, периленхиноны; антроны; бис-антроны) – 70 соединений; 9. Хроманы и хромоны; 10. Ксантоны и бис-ксантоны (почти все из них хлорсодержащие) – 87 соединений; 11. Дибензофураны (усниновая кислота и др.) – 31 соединение; 12. Дифенилэфиры (изокумарины и др.); 13. Бифенилы; 14. Дифенилметаны; 15. Ностоклиды; 16. Депсиды (ди-, три-, тетрадепсиды; бензилдепсиды) – около 200 соединений; 17. Депсидоны – более 100 соединений; 18. Депсоны; 19. Нафтопираны – 1 соединение; 20. Терпеноиды; 21. Производные пульвиновой кислоты. Как следует из обзора лишайниковых веществ, самыми многочисленными их классами являются депсиды и депсидоны, структура которых будет в дальнейшем рассмотрена. Достаточно подробно исследован химический состав применяемой в медицине цетрарии исландской. По обобщенным данным Сафоновой М.Ю. с сотр. [8] цетрария исландская содержит следующие вещества: • углеводы: - лихенин (64 %); - изолихенин (10 %); - галактоманнан; - гемицеллюлозы; - целлюлоза; - моно- и дисахариды; • лишайниковые кислоты (3 – 5 %): - лихестериновая; - протолихестериновая; - фумарпротоцетраровая; - протоцетраровая; - цетраровая (этилпротоцетраровая); - усниновая; - дигидроконстипатовая; • кислоты: щавелевая, фумаровая, лимонная, аспарагиновая, фолиевая, аскорбиновая; • ферменты: - амилаза; - инвертаза; - целлюлаза; - лихеназа; - липаза; - уреаза; - каталаза и др.; • белки (3 %); • жиры (2 %); • воска (1 %); • камеди (3,6 %); • пигменты (6,8 %); • витамин В12; • камфора; • борнеол; • стероидные соединения: - фунгистерол; - эргостерол и другие Полисахариды. Давно было замечено [9, С. 392 – 393], что при кипячении с водой цетрарии исландской образуется много слизистых, застывающих продуктов, названных “лишайниковым крахмалом” или лихенином. В настоящее время установлено, что “лишайниковый крахмал” состоит по крайней мере из двух фракций, различающихся по растворимости: нерастворимый в холодной, но растворимый в горячей воде лихенан (лихенин), и растворимый в холодной воде изолихенан (изолихенин). Учитывая полидисперсность фракций, правильнее говорить о лихенанах и изолихенанах. После их выделения горячей водой, при последующей экстракции водным раствором щелочи, получены смеси гетерополисахаридов, построенные из остатков D-маннозы, D-галактозы, D-глюкозы, гексуроновой кислоты. Лихенаны и изолихенаны представляют собой разветвленные D-глюканы, звенья которых (остатки D-глюкозы) соединены связями 1 - 3 и 1   4. Различие в том, что лихенаны построены из остатков ч-D-глюкозы, а изолихенаны – --D-глюкозы [11]. Важно отметить, что полисахаридные фракции лишайников обладают противоопухолевой активностью [12]. Наибольшее содержание лихенина в цетрарии исландской. Каротиноиды. Известно [33], что каротиноиды, наряду с другими растительными пигментами (хлорофиллами и фикобилинами), служат рецепторами световой энергии. Каротиноиды, кроме того, выполняют защитную функцию – предотвращают распад хлорофилла под воздействием молекулярного кислорода. Большинство каротиноидов имеют длинные (18 атомов углерода) полиизопреноидные цепи, на концах которых находятся ненасыщенные замещенные циклогексеновые кольца. Для некоторых каротиноидов установлена антимутагенная активность (н - каротин). Хроматографическими методами были изучены каротиноиды 33 видов лишайников из Антарктики [13]. Общее содержание каротиноидов варьировало от 23.25 до 123.5 мкг/г сухого веса. В 15 видах лишайников Анатолийского полуострова (Малая Азия) [14] установлено наличие 24 каротиноидов: т - каротин зеаксантин  - цитраурин мутатоксантин  - каротин лютеинэпоксид капсохром эхиненон  - каротин антераксантин 6 - эпоксид 4 - гидроксиэхиненон  - криптоксантин виолаксантин ликопен - 5 кантаксантин лютеин флавоксантин биксин астаксантин 3 - эпилитеин ауроксантин гетероксантин неоксантин Их общее содержание составляло от 20.49 до 81.18 мкг/г сухого веса. Другие вещества. Наибольший интерес представляют вторичные лишайниковые вещества с кислотными свойствами – лишайниковые кислоты. Каждому виду лишайника свойственен определенный набор лишайниковых кислот, которые в совокупности дают качественные реакции, позволяющие отличить одни виды лишайников от других. В качестве реагентов используют 10 % раствор гидроксида калия, насыщенный раствор гипохлорита кальция, спиртовые растворы йода, бензидина, парафенилендиамина и др. [34]. Так, например, установлены видовые различия в качественном составе лишайниковых кислот у представителей рода Parmelia [15]. Было исследовано 143 образца 16 видов. Ацетоновые экстракты наносили на хроматографические пластинки “Silufol-UV 254” и “Merc”. В качестве подвижных фаз использовали системы растворителей: а) толуол : диоксан : ледяная уксусная кислота (180 : 45 : 5); б) гексан : диэтиловый эфир : муравьиная кислота (120 : 90 : 20); в) толуол : ледяная уксусная кислота (200 : 30). После высушивания пластинок пигменты просматривали в видимом свете, ароматические вещества – в УФ-свете при 254 нм. Идентификацию компонентов проводили по величинам Rf. Для сравнения использовали химически чистые образцы лишайниковых веществ. У многих видов были найдены атранорин, леканоровая, салациновая, лобаровая и другие кислоты. Усниновая кислота была обнаружена только у Flavoparmelia caperata. Лишайниковые кислоты важны не только для диагностики лишайников, но и как природные антибиотики. Названия некоторых лишайниковых веществ даны в табл.1. Кривощековой О.Е. с сотр. обобщены результаты исследования лишайниковых кислот у представителей семейства Parmeliaceae [16]. Впервые выделены из лишайников изокумарины (3, 4), пигмент фенантренового ряда (названный бирулохиноном) (16), бинафтохиноидный пигмент (названный кукулохиноном) (17) и гидроксиметилантрахиноновые пигменты: исландицин (11) и цинодонтин (12), встречающиеся также у низших грибов. Содержание изокумаринов – о- и --коллатоловых кислот в образце Asahinea chrysantha из Тернейского района Приморского края составляло соответственно 0.30 и 0.23 %. Однако, магаданский образец этого вида содержал - и --алектороновые кислоты. Авторы высказывают предположение, что изокумарины, изомерные депсидонам, являются продуктами их катаболизма. Содержание гидроксиметилантрахиноновых пигментов в пармелиевых лишайниках было невелико – 10-5-10-3 %. Содержание бирулохинона в Parmelia birulae составляло около 10-2 %. Оригинальное строение имеет кукулохинон – пигмент красного цвета, выделенный из Cetraria cucullata, собранного в Тенькинском районе Магаданской области. По сообщению проф. Р.Томсона, приведенному в статье, пигмент, идентичный кукулохинону, был обнаружен в составе глубоководной голотурии. Данный пигмент локализуется в нижней части лишайника, вблизи минерального субстрата, где находится преимущественно в виде комплексов с металлами. Позже полигидроксинафтохиноидные пигменты были обнаружены в нижних ярко-красных кончиках талломов Cetraria islandica и Flavoparmelia cucullata [35]. Их извлечение из сырья возможно только после обработки кислотой, поскольку они образуют прочные неэкстрагируемые металлокомплексы. Автор полагает, что роль хиноидных пигментов, наряду с депсидами и меланинами, заключается в адаптации лишайников к суровым условиям обитания. Таблица 1. Некоторые лишайниковые вещества. № п/п Название Литература 1 Депсидон алектороновой кислоты [16] 2 Депсидон Д-коллатоловой кислоты 3 -алектороновая кислота 4 -коллатоловая кислота 5 Фумарпротоцетраровая кислота 6 Каператовая кислота 7 Депсидон коленсоиновой кислоты 8 Лобаровая кислота 9 Норкаператовая кислота 10 Хризофанол 11 Исландицин 12 Цинодонтин 13 Эмодин 14 Тетрагидроксиметилантрахинон 15 Пентагидроксиметилантрахинон 16 Бирулохинон 17 Кукулохинон 18 Леканоровая кислота [17] 19 Эверновая кислота 20 Гирофоровая кислота 21 Гиасциновая кислота 22 Овоивая кислота 23 Умбиликаровая кислота 24 Папулосовая кислота 25 Крустиновая кислота 26 Лозалловая кислота 27 Тенуиорин 28 Делизеивая кислота 29 Атранорин [4] 30 Усниновая кислота [4] 31 Физодовая кислота [4] 32 Рангиформовая кислота [18] 33 Гликозиды (общая формула) [19] 34-41 Ацетиленовые кислоты [20] Исследователи из Японии и США (Вильям Л.Кулберсон) установили строение депсидов и тридепсидов (18-28), выделенных из лишайников семейства Umbilicariaceae: Peltigera aphthosa, Cetrariella delisei, Umbilicaria polyphylla, Lasallia papulosa [17]. Растительный материал обрабатывали ацетоном при 40оС в течение 20 мин, компоненты разделяли методом ВЭЖХ с УФ-детектором (254 нм). Колонку типа Beckman Ultrasphere ODS-5   (10 ( 250 мм) элюировали растворами метанола переменной концентрации со скоростью 2 млсмин-1 в течение 90 мин. Химическую структуру изучали методами ЯМР и масс-спектроскопии. Отмечено, что исследованные вещества важны для хемотаксономической характеристики лишайников семейства Umbilicariaceae. Распространенным веществом в лишайниках является атранорин (29) – бесцветное кристаллическое вещество с температурой плавления 192-194оС. Классический метод выделения атранорина основан на различной растворимости лишайниковых веществ в органических растворителях. Лучше всего атранорин растворяется в кипящем бензоле, хлороформе, ксилоле; плохо растворяется в кипящем этаноле и диэтиловом эфире; не растворяется в воде, холодном этаноле, холодном диэтиловом эфире [4]. Наибольшее применение в медицине имеет усниновая кислота (30) – кристаллическое вещество желтого цвета. Усниновая кислота оптически активна, и в лишайниках встречаются обе ее формы, незначительно различающиеся по температуре плавления и удельному вращению. Усниновая кислота хорошо растворима в бензоле, хлороформе, амиловом спирте, ледяной уксусной кислоте; плохо растворима в этаноле, петролейном эфире, диэтиловом эфире; нерастворима в воде. Содержание усниновой кислоты в лишайниках составляет от 0,2 % (Cladonia sylvatica) до 4,0 % (Alectoria ochroleuca) [4]. Физодовая кислота (31) представляет собой бесцветное кристаллическое вещество с температурой плавления 199-202оС (с разл.). Хорошо растворима в этаноле, диэтиловом эфире, ацетоне; плохо – в хлороформе и бензоле; в воде почти нерастворима. Содержание физодовой кислоты в лишайнике Pseudevernia furfuracea составляет по данным [4] от 3 до 5 %. К числу высших дикарбоновых кислот принадлежит рангиформовая кислота (32). Ее строение было уточнено методом ЯМР исследователями из Канады и Н.Зеландии [18]. Источником получения рангиформовой кислоты служил лишайник Cladina retipora. Сотрудники Иститута микробиологии (Чехия) и Института экологии бассейна р.Волга АН России недавно выделили и установили строение новых гликозидов лишайниковых кислот (33) из 9 видов лишайников, произрастающих у берегов озера Иссык-Куль в Средней Азии: [19]. В молекуле (33) одним или двумя заместителями R могут быть остатки глюкозы (реже – два остатка глюкозы). Оставшиеся R – атомы водорода. Таким образом, некоторые гликозиды могут быть отнесены к производным олигосахаридов. В основном из тех же видов лишайников, произрастающих вокруг озера Иссык-Куль, были выделены ацетиленовые кислоты (34-41). Лишайники обрабатывали смесью хлороформа и метанола в соотношении 1 : 1. Экстракт фракционировали на колонке Sephadex LH-20 и методом обратимо-фазовой ВЭЖХ. Строение выделенных компонентов устанавливали методами 1Н- и 13С-ЯМР, а также масс-, ИК- и УФ-спектроскопии. Ацетиленовые кислоты имеют необычное для природных соединений строение. Они являются одноосновными высшими ненасыщенными карбоновыми кислотами с несколькими кратными связями и 1-2 атомами брома в молекуле. В одной структуре обнаружено также кольцо циклопропана, в другой – оксирана (окиси этилена). Ацетиленовые кислоты обладают антимикробной, цитотоксической и ихтиотоксической активностью, являются ингибиторами действия некоторых ферментов. Содержание отдельных ацетиленовых кислот в лишайниках составляло от 0.3 до 13.1 мг/50г сухой массы [20]. Австралийские исследователи [21] из Xanthoparmelia scabrosa выделили скаброзиновые эфиры, представляющие собой эпидитиопиперазиндионы. Строение изучали методами ЯМР-спектроскопии и рентгено-структурного анализа. Авторы установили цитотоксическую активность некоторых эфиров для линии клеток мышиной мастоцитомы Р815 и клеточной линии MCF7 молочной железы человека. Структурные формулы производных антрахинона, обнаруженных в лишайнике Xanthoria parietina [10]: A – фаллацинал, B – париетин, C – париетиновая кислота, D – цитреорозеин, E – моноацетилфаллацинол, F – 1,8-дигидрокси-6-метокси-3-(-оксобут--енил)-антрахинон. Применение лишайников и лишайниковых антибиотиков в медицине Применение лишайников в медицине основано на содержании в них уникальных и достаточно разнообразных биологически активных веществ в основном антимикробного действия. Cetraria islandica (цетрария исландская). Наибольшую известность в медицинской практике получил так называемый “исландский мох” – лишайник Cetraria islandica. Издавна применялась цетрария исландская при чахотке, хронических бронхитах, поносах, как питательное и укрепляющее средство. В 19 веке этот лишайник считался также прекрасным кормом для оленей и свиней, в голодные годы его использовали для выпечки хлеба. Цетрария исландская широко применялась исландцами на протяжении около 200 лет. Врачи давали ее больным, истощенным тяжелыми болезнями [9, С. 392 – 393; 10, С. 134 – 135]. Цетрария исландская входит в список лекарственных растений Беларуси. Лекарственные формы – настой и сборы, а также растворы уснината натрия. Применение основано на слизеобразующем, бактерицидном, противопотном и противорвотном действии. Лишайниковые кислоты (усниновая, протолихестериновая, протоцетраровая и др., 3 – 5 %) угнетают рост грамположительных микроорганизмов и туберкулезной палочки человека. Применяют цетрарию исландскую при острых респираторных заболеваниях верхних дыхательных путей, воспалении горла и ротовой полости, заболеваниях желудка, язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки, пониженной кислотности, слабом пищеварении и усвоении, общем исхудании и слабости, а также после перенесенных тяжелых заболеваний или операций [6]. Цетрарию исландскую используют также для лечения гриппа и простудных заболеваний. Для приготовления отвара рекомендуют 20 г сухого измельченного сырья залить 0.5 л горячей воды или молока, кипятить на медленном огне 5 мин и настаивать 30 мин. Принимать по полстакана 3 раза в день. При кашле рекомендуют принимать настой цетрарии исландской (1 часть), листьев мать-и-мачехи (1.5 части) и листьев эвкалипта (0.5 части). 2 столовые ложки сбора залить 0.5 л кипятка, настоять 30 мин в эмалированной посуде и пить горячим по 1/3 стакана 3 – 4 раза в день [7, С. 75 – 77]. Сотрудники Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии сравнивали гастрозащитное действие сухого экстракта (экстрагент – этанол) из Cetraria islandica, экстракта из однолетних побегов Caragana spinosa и препарата “Масло облепихи”. Сначала подопытным крысам вводили растворы бутадиона и аспирина для деструкции слизистой желудка. Доза сухого экстракта из Cetraria islandica составляла 94 мгмкг-1, из Caragana spinosa – 93 мгмкг-1. Оказалось, что активность экстракта из Cetraria islandica значительно выше активности других препаратов. Механизмы действия экстрактов и “Масла облепихи” были неодинаковы [22]. Обзорная информация о применении цетрарии исландской в медицине содержится в статье Сафоновой М.Ю. с соавт. [8]. Авторы сообщают о разработанных в конце 20 века в России и за рубежом лекарственных средствах на основе экстрактов из цетрарии исландской. Так, в Исландии разработаны капсулы с экстрактами цетрарии исландской различного состава, применяемые при острой непроходимости кишечника, язве желудка, респираторных заболеваниях, артритах, астме, пониженной функции иммунной системы, отеках. В Германии разработаны таблетки с экстрактом цетрарии исландской, содержащие полисахариды и лишайниковые кислоты, а также детские конфеты с цетрарией исландской, применяемые в качестве средства для профилактики кашля, простуды, обладающие муколитическим действием. В России оформлен патент на средство для лечения мастопатии “Цетрис” (Мельникова, 1995). Parmelia reticulata (пармелия блуждающая). Главная роль в комплексе биологически активных веществ пармелии блуждающей отводится усниновой кислоте. Усниновую кислоту экстрагируют из пармелии блуждающей путем кипячения в смеси ацетона и этанола (выход 0.17 %). Разработан модифицированный метод получения усниновой кислоты, который отличается простотой и экономичностью (выход 2.5 %) [23]. Evernia prunastri (эверния сливовая). Эверния сливовая является ценным продуктом для парфюмерной и фармацевтической промышленности [24]. В середине 20 века немецкий исследователь Клоза разработал очень эффективный препарат против стафилококков и стрептококков – эвозин. Источником получения эвозина являлась главным образом эверния сливовая. Эвозин представляет собой смесь эверновой и усниновой кислот с некоторыми индифферентными к микроорганизмам веществами [31]. Недавно установили противогрибковую активность ацетоновых экстрактов из 3 видов лишайников, в том числе из эвернии сливовой [25]. Активность экстрактов и отдельных лишайниковых кислот изучали по отношению к 8 видам фитопатогенных грибов. Натрия уснинат. Натрия уснинат представляет собой бледно-желтый блестящий кристаллический порошок, растворимый в горячей воде (1 : 200) и спирте (1 : 20). Применяется для лечения ран, ожогов, трещин и т. д. Назначают в виде 1 % водно-спиртового или 0.5 % раствора в касторовом масле, а также в виде раствора в глицерине или пихтовом бальзаме с добавлением 2 % анестезина. Применяется также препарат в порошке или в смеси с сульфаниламидами (1 часть натрия уснината с 3 или 5 частями стрептоцида). Формы выпуска: порошок; 1 % раствор в этаноле; 0.5 % раствор в касторовом масле с добавлением 2 % анестезина; 0.3 и 0.5 % растворы в пихтовом масле во флаконах по 25 и 50 мл [25, С. 429 – 430]. Таким образом, в настоящее время в ряде стран мира (Россия, Чехия, Германия, Израиль, США, Япония, Канада, Бразилия, Австралия, Н.Зеландия и др.) лишайниковые вещества являются объектом детальных исследований. Эти вещества лежат в основе хемотаксономии лишайников (т. е. их классификации по химическим признакам), а также представляют интерес как природные антибиотики. Познание структуры и свойств уникальных лишайниковых антибиотиков открывает пути к поиску их синтетических аналогов. Лишайниковые антибиотики представляют собой фенольные соединения, для извлечения которых из растительного сырья чаще всего применяют хлороформ. Однако, их растворимость в хлороформе неодинакова, и некоторые вещества выделяются при охлаждении растворителя. Так, например, в виде белой массы выделяется эверновая кислота после охлаждения хлороформа, которым при нагревании обрабатывали сухой эфирный экстракт из эвернии сливовой [4, С.48]. Эверновая кислота нерастворима в холодном хлороформе благодаря наличию в молекуле корбоксильной группы, а также карбоксилатной, связывающей бензольные кольца (см. структуру 19). Различие в растворимости в горячем и холодном хлороформе дает возможность отделения эверновой кислоты от других фенольных соединений. Эверновая и другие ароматические карбоновые кислоты растворимы в растворителях основной природы: этаноле, диэтиловом эфире, ацетоне. Но и здесь их растворимость избирательна и зависит от структуры и молекулярной массы вещества. Вещества с этерифицированными метанолом карбоксильными группами, например, атранорин (см. структуру 29), наоборот, хорошо растворимы в хлороформе, а также в ароматических углеводородах (бензол, ксилол). Лишайниковые антибиотики практически нерастворимы в воде, но растворяются при ее подщелачивании содой или гидроксидом натрия. Следует подчеркнуть, что наличие у многих веществ сложноэфирной связи делает эти вещества неустойчивыми (легко гидролизуемыми). Нельзя также исключать и процессы окисления. Идентификацию лишайниковых веществ проводят по температуре плавления, качественным химическим реакциям (например, в спиртовой среде с хлорным железом, гипохлоритом кальция), а также по данным ИК-, ЯМР-спектроскопии, и другими методами [4, 10]. Разделение осуществляют методами ТСХ [15], колоночной хроматографии [15], а также жидкостной экстракцией [4]. Усниновая кислота Усниновая кислота относится к числу наиболее известных лишайниковых антибиотиков. Многие исследователи изучали способы ее получения и химические свойства еще в начале 20 века. Тем не менее, химическое строение усниновой кислоты было точно установлено лишь в 1950-х годах [4] (см. структуру 30). Получение и очистка усниновой кислоты осуществляется в несколько стадий [4, С.46]. Вначале измельченный воздушно-сухой лишайник обрабатывают горячим бензолом. Бензол отгоняют, а сухой остаток растворяют в минимальном количестве горячего хлороформа. Затем к нему добавляют тройной объем холодного этилового спирта и экстрагируют им примеси. Усниновая кислота с остатками примесей выпадает в осадок. Его вновь растворяют в минимальном количестве горячего хлороформа и вторично обрабатывают тройным объемом холодного этилового спирта. Усниновая кислота остается со следами примесей, которые удаляют холодным диэтиловым эфиром. Если для выделения усниновой кислоты вместо бензола применяется хлороформ, то хлороформенный экстракт упаривается не досуха, а остается в минимальном количестве. В остальном осуществляется тот же процесс очистки. Усниновая кислота оптически активна и в лишайниках встречаются обе ее формы: d- и l-формы, а также ее рацемат. Температура плавления d- и l-форм соответственно и , рацемата - . Усниновая кислота представляет собой желтое кристаллическое вещество, нерастворимое в воде, плохо растворимое в петролейном эфире, диэтиловом эфире, спирте, умеренно растворимое в горячем диэтиловом эфире, хорошо растворимое в бензоле, хлороформе, амиловом спирте, ледяной уксусной кислоте. Благодаря фенольной природе усниновая кислота умеренно (на холоду) растворяется в растворах бикарбоната натрия и аммиака, легко растворяется в растворах щелочей и гидроксида бария, образуя желтые растворы. Усниновая кислота растворяется в концентрированной серной кислоте с образованием оранжево-желтого раствора. В спирте усниновая кислота мгновенно обесцвечивает раствор перманганата калия и дает коричнево-красное окрашивание с хлорным железом. С реактивом Эрлиха (0,125 г п-диметиламинобензальдегида, 65 мл серной кислоты, 35 мл воды) усниновую кислоту нагревают до тех пор, пока смесь не сделается красновато-бурой. Затем ее охлаждают и разбавляют этиловым спиртом. Раствор принимает интенсивно синий цвет. Разработаны два метода количественного определения содержания уснината натрия в препарате “Бинан” [4, С. 58 – 59]. Первый метод основан на разложении соли соляной кислотой и определении избытка последней щелочью, второй – на прямом потенциометрическом титровании уснината натрия соляной кислотой. Следует указать на необычный вид кривых титрования, построенных авторами [4]. Кривая титрования уснината натрия в слабощелочной области, после точки полуэквивалентности, неожиданно проходит через максимум, а затем снова принимает нормальный вид. Авторы предполагают образование в начале титрования нестойкого комплекса, который распадается в дальнейшем. Константа диссоциации усниновой кислоты оценена приближенно по уравнению гидролиза – путем измерения рН раствора ее соли. Величина рК по данным [4] составляет около 4.9. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ По литературным данным, лишайник Xanthoria parietina отличается содержанием разнообразных гидроксильных производных антрахинона, которые обуславливают его оранжево-жёлтую окраску. Известно, что природные антрахиноны применяются в медицине. Данный вид лишайника широко распространён и встречается как в дикой природе , так и в крупных городах. Следовательно, он может служить перспективным источником природных антрахинонов. В литературе описано 6 гидроксильных производных антрахинона, обнаруженных в Xanthoria parietina , в том числе 1 соединение с карбоксильной группой в молекуле - париетиновая кислота. Классические методы выделения и разделения антрахинонов основаны на различной их растворимости в воде и органических растворителях в зависимости от pH среды. Методики проведения эксперимента Сначала биомассу обработали водным раствором соляной кислоты для удаления катионов металлов, отмывали дистиллированной водой и высушивали. Как известно, лишайники концентрируют тяжёлые металлы в окружающей среде, являясь их биоиндикаторами. Катионы металлов связываются лишайниками за счёт органических кислот, которые образуют с ними прочные комплексные соединения. Поэтому целесообразно обработать биомассу кислотой для разрушения комплексных соединений. Свободную от катионов биомассу обрабатывали органическими растворителями: вначале гексаном, а затем бензолом. При этом гексаном экстрагировались высшие углеводороды, высшие карбоновые кислоты и их глицериды, стероиды, каротиноиды, антрахиноны и хлорофиллы. Последующая обработка бензолом извлекает оставшиеся вещества: париетиновую кислоту, антрахиноны без карбоксильной группы и хлорофиллы. На фото 1. –биомасса лишайника Xanthoria Parientina доставленная в химическую лабораторию. Анализ гексановой фракции Гексановый экстракт поместили в делительную воронку и обрабатывали порциями 0,2 мольмл. .NaOH . После встряхивания первой порции NaOH и гексановой фракции и расслоения воды раствор щёлочи окрасился в интенсивный вишнёво-красный цвет. Это свидетельствует об образовании окрашенных солей антрахинонов. Для полноты извлечения антрахинонов из гексановой фракции её обрабатывали щёлочью многократно до тех пор, пока щёлочь перестала окрашиваться. Щелочной окрашенный раствор поместили в делительную воронку и подкислили серной кислотой до изменения окраски с красной на жёлтую. При этом наблюдалось выпадение жёлтых хлопьев вещества. В делительную воронку добавили гексан, встряхнули и дали некоторое время отстояться. При этом жёлтые вещества полностью перешли в гексан и окрасили в лимонно-жёлтый цвет. Водный раствор слили, а гексановый профильтровали через сухой бумажный фильтр для удаления следов влаги. Наконец гексановый экстракт перелили в чашку Петри и поставили в вытяжной шкаф для улетучивания растворителя. На дне чашки образовался налёт жёлтого вещества (антрахиноны). Фото 1 Биомасса лишайника Xanthoria Parientina Анализ бензольной фракции Бензольную фракцию поместили в делительную воронку и обработали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия. При таком способе обработки происходит отделение париетиновой кислоты от других антрахинонов. Дело в том, что молекулы париетиновой кислоты содержат карбоксильную группу, которая оказывает сильное влияние на растворимость этого вещества. Париетиновая кислота не растворима в гексане, но растворима в бензоле и в водных растворах гидрокарбоната натрия. Антрахиноны, не содержащие карбоксильные группы, не растворяются в водном растворе гидрокарбоната натрия. Окрашенный водный раствор париетиновой кислоты отделили от бензольного раствора, подкислили в делительной воронке и обработали бензолом. Бензол упарили, в остатке получили париетиновую кислоту. Оставшиеся антрахиноны извлекли из бензольного раствора 0.2мольмл. гидриксидом натрия. Затем их выделяли как в предыдущем опыте. В бензоле остались неизвлекаемые хлорофиллы. На фото 2 показано разделение пигментов в делительной воронке Фото 2 Разделение пигментов в делительной воронке Природные антрахиноны, кислотно-основные индикаторы, изменяющие окраску в зависимости от pH среды (фото 3). Фото 3 Окраска раствора париетиновой кислоты в зависимости от рН Получение спектров поглощения выделенных фракций Для спектрофотометрирования готовили растворы выделенных веществ в органических растворителях. Париетиновую кислоту растворили в ацетоне, а париетин в этаноле. Анализ проводили на спектрофотометре СФ – 26 (фото 4). Спектр снимали в интервале от 400 – 700 нм через каждые 5 нм. По полученным данным с использованием программного пакета Microsoft Origin 7 строили спектры поглощения (фото 5). Идентификацию соединений проводили, сравнивая максимумы поглощения с литературными данными. Фото 4 Полученные фракции и их анализ на спектрофотометре СФ-26. Фото 5 Подготовка электронной версии проделанной работы. Обсуждение результатов эксперимента Химический состав лишайника Xanthoria parietina как и всякого растительного объекта очень сложный. В настоящее время в литературе описано около тысячи веществ, выделенных из лишайников. Вид Xanthoria parietina отличается наличием большого количества пигментов. К таким пигментам относятся хлорофиллы и каротиноиды, которые присутствуют у всех растений, и антрахиноны, которые встречаются в растительном мире не так широко. По литературным данным в составе Xanthoria parietina обнаружены 6 антрахиноновых соединений. Данные вещества относятся к гидроксипроизводным антрахинонам и проявляют все своиства фенолов. Они растворяются в органических растворителях (бензоле) и окрашивают их в жёлтый цвет. В виде солей (фенолятов) они, наоборот, нерастворимы в органических растворителях, но хорошо растворимы в воде. На этом свойстве основаны классические методы разделения. Париетиновая кислота в отличии от других антрахинонов содержит карбоксильную группу в молекуле, поэтому она была выделена путём обработки бензольного раствора гидрокарбонатом натрия. Смысл данной реакции в том, что более сильная кислота (париетиновая) вытесняет более слабую (угольную) из соединений. Антрахиноны, не имеющие карбоксильную группу, не вступают в эту реакцию, т.к. они являются более слабыми кислотами, чем угольная. После извлечения париетиновой кислоты оставшиеся антрахиноны были извлечены раствором щёлочи; например: Установлено, что наличие карбоксильной группы в молекуле париетиновой кислоты делает возможным её отделение от других антрахинонов. При обработке бензольного раствора антрахинонов водным раствором гидрокарбоната натрия в водный слой переходит только париетиновая кислота в виде натриевой соли (т. е. нейтрализация по COOH-группе). Париетиновую кислоту идентифицировали по электронному спектру поглощения в ацетоне (максимумы при 325 и 432 нм), а париетин – по электронному спектру поглощения в этаноле: Спектр поглощения париетиновой кислоты в ацетоне Спектр поглощения париетина в этаноле Разработанная экстракционная методика выделения париетиновой кислоты и париетина может быть апробирована в научно-исследовательских учреждениях и рекомендована к применению в малотоннажном химическом производстве. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Подводя итог проделанной работе, можно сформулировать следующие выводы: 1) Установлено, что лишайник Xanthoria parientina в значительном количестве содержит антрахиноны и, следовательно, может служить дешёвым и доступным источником их получения. Заготовку лишайника целесообразно проводить на лесоповалах. 2) Установлено, что с использованием гексана и бензола можно разделить антрахиноны по группам в зависимости от их растворимости. При этом париетиновая кислота растворима в бензоле и может быть извлечена из него водным раствором гидрокарбоната натрия. Однако, париетиновая кислота нерастворима в гексане из-за наличия в ней карбоксильной группы. Париетин растворим в горячем гексане, но выпадает из него при охлаждении раствора. В молекуле париетина карбоксильная группа отсутствует. 3) Разработанная методика может использоваться для выделения антрахинонов из лишайников, их дальнейшего использования в медицине в качестве антибиотиков, а также в аналитической химии в качестве индикаторов. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Голубкова Н.С. К вопросу о происхождении и путях эволюции лишайникового симбиоза. // Новости систематики низших растений. – 1993. – Т. 29. – С. 84 – 104. 2. Жизнь растений. В 6-ти т. Т.3. Водоросли. Лишайники. Под ред. Проф. Голлербаха М.М. – М.: Просвещение, 1977. – 487 с. 3. Курсанов А.Л., Дьячков Н.Н. Лишайники и их практическое использование. – М.: Изд-во АН СССР, 1945. – 55 с. 4. Моисеева Е.Н. Биохимические свойства лишайников и их практическое значение. – М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1961. – 82 с. 5. Землинский С.Е. Лекарственные растения СССР. – М.: Госуд. Изд-во мед. Лит-ры, 1958. – 610 с. 6. Сенчило В.И., Сенчило Ю.В. Лекарственные растения Беларуси. – Мн.: БГУ, 2004. – 168 с. 7. Онипко В.Д. Лечение гриппа и простудных заболеваний средствами народной медицины. – СПб.: ТОО “Диамант”, ООО “СМИО Пресс”, 1997. – 192 с. 8. Сафонова М.Ю., Саканян Е.И., Лесиовская Е.Е. Cetraria islandica (L.) Ach.: химический состав и перспективы применения в медицине. // Растительные ресурсы. – 1999. – Т. 35. – Вып. 2. – С. 106 – 115. 9. Брокгауз Ф.А., Ефрон И.А. Энциклопедический словарь. Т. 13. – С.–Петербург: Типо-Литография И.А.Ефрона, 1894. – 480 с. 10. Huneck S., Yoshimura I. Identification of lichen substances. – Berlin: Springer, 1996. – 493 p. 11. Структурное исследование полисахаридов лишайников Cetraria cucullata и C.islandica. / Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков В.А. и др. // Биоорганическая химия. – 1997. – Т. 23. – № 2. – С. 134 – 138. 12. Вайнштейн Е.А. О лишайниковых углеводах. // Новости систематики низших растений. – 1993. – Т. 29. – С. 73 – 83. 13. Bazyli C., Masakane I., Kumar U.D. Carotenoids in lichens from the Antarctic. // Antarct. Rec. – 1996. – Vol. 40. – P. 247 – 254. 14. Bazyli C., Aysen O., Sule O. Lichen caratenoids on the Anatolian Peninsula. // Ann. Mus. Goulandris. – 1999. – № 10. – P. 53 – 62. 15. Брунь Г.О. До вивчения хемотаксономічних особливостей лишайників роду Parmelia s. L. (Parmeliaceae). // Укр. Ботан. Журнал. – 2002. – Т. 59. – № 5. – С. 607 – 612. 16. Химическое изучение дальневосточных представителей семейства Parmeliaceae. / Кривощекова О.Е., Максимов О.Б., Степаненко Л.С., Мищенко Н.П. // В сб.: Брио-лихенологические исследования в СССР. – Апатиты: Изд-во Кольского филиала АН СССР, 1986. – С. 101 – 104. 17. NMR assigments of desides and tridepsides of the lichen family umbilicariaceae. / Narui T., Sawada K., Takatsuki S. et al. // Phytochemistry. – 1998. – Vol. 48. – P. 815 – 822. 18. Benn M.H., Lorimer S.D., Perry N.B. Revision of structure of rangiformic acid. // Phytochemistry. – 1998. – Vol. 47. – № 8. – P. 1649 – 1652. 19. Rezanka T., Guschina I. A. Further glucosides of lichens’ acids from Central Asian lichens. // Phytochemistry. – 2001. – Vol. 56. – P. 181 – 188. 20. Rezanka T., Dembitsky V. Novel brominated lipidic compounds from lichens of Central Asia. // Phytochemistry. – 1999. – Vol. 51. – P. 963 – 968. 21. Structure revision and cytotoxic activity of the scabrosin esters, epidithiopiperazinedioines from the lichen Xanthoparmelia scabrosa. / Ernst-Russel Micheal A., Chai Christine L.L., Hurne Alanna M. Et al. // Austral. J. Chem. – 1999. – Vol. 52. – № 4. – P. 270 – 283. 22. Влияние сухих экстрактов из слоевищ Cetraria islandica (L.) Ach. И из однолетних побегов Caragana spinosa (L.) Vahl ex Hornem. На развитие экспериментальной язвы желудка у крыс. / Дихтяренко В.В., Сафонова М.Ю., Сафонов В.В. и др. // Растительные ресурсы. – 2001. – Т. 37. – № 2. – С. 51 – 56. 23. Худайбергенова А.М., Махатов Б.К., Токешова Л.Е. Лишайники как источник биологически активных веществ. // Фармация в 21 в.: инновации и традиции: Тез. докл. Междунар. Науч. конф., Санкт-Петербург, 7 – 8 апр., 1999. – СПб., 1999. – С. 214 – 215. 24. Персидская К.Г., Касимовская Н.Н. Лишайники – как источник получения продуктов для парфюмерии и медицины. // Лесные биологически активные ресурсы (березовый сок, живица, эфирные масла, пищевые, технические и лекарственные растения). Материалы 2 Международной конференции, Хабаровск, 21 – 23 сент., 2004. – Хабаровск, 2004. – С. 268 – 270. 25. Patrice H., Chantal V.H. Antifungal activity of lichen extracts and lichen acids. // Biocontrol. – 2004. – Vol. 49. – № 1. – P. 95 – 107. 26. Using lichen tissue cultures in modern biology. / Yamamoto Y., Miura Y., Higuchi M. et al. // Bryologist. – 1993. – Vol. 96. – P. 384 – 393. 27. Xanthones from cultured lichen mycobionts of Pyrenula japonica and Pyrenula pseudobufonia. / Tanahashi T., Takenaka Y., Ikuta Y. et al. // Phytochemistry. – 1999. – Vol. 52. – P. 401 – 405. 28. Three isocoumarins and a benzofuran from the cultured lichen mycobionts of Pyrenula sp. / Takenaka Y., Tanahashi T., Nagakura N. et al. // Phytochemistry. – 2004. – Vol. 65. – № 23. – P. 3119 – 3123. 29. 6H-Dibenzo [b, d] pyran-6-one derivatives from the cultured lichen mycobionts of Graphis spp. And their biosynthetic origin. / Tanahashi T., Takenaka Y., Nagakura N., Hamada N. // Phytochemistry. – 2003. – Vol. 62 : 1. – P. 71 – 75. 30. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В 2-х т. Т. 2. – Изд-во 13-е, новое. – Харьков: Торсинг, 1998. – 592 с. 31. Klosa J. Evosin, ein neues Antibiotikum aus Flechten. // Deutsch. Gesundheitsw. – 1949 b. – № 16. – SS. 691 – 696. 32. Ильин В.Б. Элементный химический состав растений. – Новосибирск: Наука, 1985. – 129 с. 33. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки. Пер. с англ. – М.: Мир, 1974. – 957 с. 34. Горбач Н.В. Определитель листоватых и кустистых лишайников БССР. – Мн.: Наука и техника, 1965. – 179 с. 35. Степаненко Л.С. Роль фенольных метаболитов в дальневосточных лишайниках. // Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока: Материалы научной конференции, Владивосток, 2001. – С. 187 – 189. 36. Георгиевский В.П., Казаринов Н.А., Каррыев М.О. Физико – химические методы анализа биологически активных веществ растительного происхождения – Изд – во «ЫЛЫМ» АШХАБАД, 1976. – 240 с. 37. Справочник биохимика: Пер. с англ./ Досон Р., Элиот Д., Джонс К. – М.:Мир, 1991. – 544с. ?? ?? ?? ?? 3