genseq

В том то и дело, что эти колечки многое объясняют. Например, сверхтекучесть жидкого гелия, электропроводность металлов, химическую нейтральность благородных газов, прочность стали, сверхпрочность алмаза и т.п.. Жалко, что этого никто не видит.

Описал новую теорию строения электронных оболочек атомов и молекул на Хабре: Электронные оболочки атомов и молекул / Хабр (habr.com) Но туда химики забредают очень редко, а хотелось бы знать их (т.е. Ваше) мнение. Буду признателен за любые критические замечания.

Извините, не получал. Да и оповещения об ответах в этой теме что-то не приходят. Наверное, не разобрался с настройками и что-то напутал. Напишите ещё раз напрямую - genseq(at)mail.ru Например, здесь. Правда, Иллюминовцы в синтезах литий не упоминают. Используют натриевую соль. zavgorodny2000.pdf Кстати, о синтезе азидных линкеров. Наука не стоит на месте: Iodine-Catalyzed Three-Component Reaction_2009.pdf Похоже, можно уложиться в одну стадию, если использовать катализируемую йодом трёхкомпонентную реакцию этиленгликоля (спирт), глутарового альдегида и триметилсилилазида в дихлорметане (с избытком альдегида). А концевые альдегидные группы окислить до карбоксильных добавлением водного раствора карбоната натрия (т.е. использовать для окисления имеющийся там йод с переводом продуктов в водную фазу). И очистить от глутаровой кислоты и прочих примесей хроматографией. Что скажут специалисты?

Насчёт аптеки - это шутка. Но в каждой шутке есть только доля шутки. Например, для замещения брома азидом лучше использовать не азид натрия, а азид лития. Хотя литий можно добавить в качестве катализатора реакции к натриевой соли. Наверное, подойдёт и карбонат лития, который в аптеках имеется. Там же есть и йодоформ. Его-то уж точно проще всего купить в аптеке. Если заместить один атом йода азидом, а второй - молочной кислотой (тоже продаётся в аптеках), то останется что-то придумать с третьим. Или использовать его напрямую для соединения с торчащим из основания аллиламином. Правда, флуорофор придётся "навешивать" через карбоксильную группу, но это не самая сложная задача. Проблема в том, что линкер должен быть длинным и гибким. Т.е. желательно встроить в него не меньше двух молекул этиленгликоля. А лучше диэтиленгликоля.

Наверное тем, что для меня такой синтез кажется слишком сложным. Насчитывает 6 стадий. И используется много реагентов, которые нельзя купить в аптеке. Вот выписка из патента: https://yadi.sk/i/aZSyg5L6uaFg8

В этом году в США стартовала программа, нацеленная на секвенирование миллиона геномов американцев, а в Китае собираются "замутить" проект по секвенированию ста миллионов Китайцев. Причём во всех подобных проектах используется флуоресцентная технология компании Illumina, основанная на синтетических дНТФ с флуорофорами, присоединёнными к основаниям через азид-содержащий линкер, да ещё и с метилазидной блокировкой 3'-OH группы у дезоксирибозы. С непривычки звучит страшновато, но если посмотрите в патентах способы синтеза азидных линкеров, то станет ещё страшнее. Для России секвенирование народонаселения является непозволительной роскошью из-за дороговизны расходных реагентов, т.е. этих самых модифицированных дНТФ. Модифицировать нуклеотиды способны 3...4 группы отечественных химиков, но для начала было бы неплохо освоить синтез азидных линкеров. Причём главное в этом деле не столько синтез требуемого соединения, сколько разработка простейшего варианта его синтеза. Или даже просто теоретическая проработка этого вопроса (показывающая, что "не так страшен чёрт, как его малюют"). На рисунке показана общая структура модифицированного дНТФ. Выделены азидные группы, восстановление которых (фосфинами, меркаптоэтанолом и т.п.) приводит к удалению флуорофора и высвобождению блокированного 3'-OH конца дезоксирибозы. Посадить на 3'-конец метилазидный блокатор (AZM) не слишком сложно. Это было освоено ещё в прошлом веке Завгородним (ИБХ РАН). Не меченые трифосфаты такого типа даже имеются в продаже: https://azcobiotech.com/reagents/pcr-sequencing-reagents/3-azm/ Есть в продаже и флуорофоры с различными функциональными группами, и аминоаллильные производные трифосфатов, к которым можно "пришивать" флуорофоры. А вот линкеры для такой пришивки отсутствуют. Отсюда - вопрос: нельзя ли как-нибудь попроще синтезировать требуемые линкеры? Сам в синтезах не разбираюсь, так что если что-то и придумаю, то, скорее всего, окажется глупостью. Буду признателен за любые вопросы, предложения и соображения.

Очень рад, что подобные синтезы не являются для Выс особой проблемой. Правда, в действительности задачка сложнее, чем я её здесь представил. Структуры подобных димерных красителей являются большим коммерческим секретом. Известны только некоторые формулы (например, димерный этидий). Недавно наши химики разобрались со структурой SYBR Green I. который ещё недавно был весьма популярен у мол. генетиков. Но он очень нестоек в водных растворах.Сейчас появились и более стойкие, и более яркие флуорофоры - GelRed™, ADyNA™, EvaGreen™ и т.д.. Судя по спектрам, последний является димерным производным Acridine Orange: Впрочем, это может быть и что-то вроде Acridine homodimer [bis-(6-chloro-2-methoxy-9-acridinyl)spermine]. В общем, если всерьёз заниматься подобными синтезами, то рассчитывать на быстрый успех не приходится. Скорее всего, придётся помучиться и с синтезами, и с анализом свойств димерных флуорофоров. Впрочем, не раз наблюдал. что дуракам везёт. Поэтому хочется попытаться сделать наобум простейший акридиновый димер (замес эпоксидной смолы с 9-аминоакридином). А вдруг эти глупость сработает?

А вот ещё один флуорофор: Ethidium homodimer 1 (EthD-I or EtDi) 2 mM DMSO solution Soluble in DMSO Store at 4°C C46H50Cl4N8 MW : 856.78 λexc.(in H2O, no DNA) : 493 nm ; EC : 9 100 M-1cm-1 λexc./λem. (with DNA) : 528/617 nm ; EC : 7 000 M-1cm-1 Absorption and fluorescence emission spectra of ethidium homodimer-1 bound to DNA. Ethidium homodimer is a high affinity fluorescent nucleic acid stain (tights 1 000 times that of Ethbr). It binds to both DNA and RNA in a sequence-independent manner and with a >30-fold fluorescence enhancement. The DNA binding of each Ethidium Homodimer covers four base pairs and is believed to occur by intercalation. Because the dye is highly positively charged, and of large size, it's too polar and can not cross cell membranes to stain living cells. It can be excited by the argon-ion laser (FCM) and with standard UV transilluminators. FluoProbes® Ethidium homodimer is of highest purity, devoid of inorganic salts that are found in other suppliers, and lowers the needed amount and thus background. Applications : It is very useful to detect nucleic acids in solution, or cells with compromised membranes. When used as a viability indicator, EthD-1 typically does not require a washing step because very low concentrations are needed (safer than Eth,br and PI). DNA can be prestained with dye before separation by gel electrophoresis. Detection sensitivity of 30–60 picograms DNA per band on polyacrylamide gels using a confocal laser–based scanning system. Has also been used to detect DNA in solution. References : Biochemistry 17, 5078(1978) ; Anal. Biochem. 94, 259(1979) ; Bioorg. Med. Chem. 3, 701(1995) ; Nucleic Acids Res. 23, 2413(1995).

Например: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/su....cgi?cid=153631 Только хотелось бы иметь незаряженный гибкий линкер (триэтиленгликоль и т.п.). Этилендиаминовый линкер, скорее всего, будет слишком сильно тормозить электрофоретическую подвижность ДНК из-за избытка положительных зарядов.

Для окрашивания ДНК используются интеркалирующие флуоресцентные красители (этидиум бромид, акридин и т.п.). За бугром сейчас наловчились синтезировать их димеры, которые: 1. Без ДНК флуоресцируют намного меньше (контактное тушение); 2. Соединяются с ДНК намного прочнее; 3. Трубуются в гораздо меньших концентрациях и, соответственно, почти не дают фонового свечения. Недостаток - запредельная цена (1 мл 1% р-ра стоит >100$ + таможня). Есть ощущение, что смешав 9-аминоакридин (упаковка 25 г стоит 250...300 руб.) с линкером типа триэтиленгликоля с эпоксигруппами на концах (ТЭГ-1, основной компонент некоторых эпоксидных смол, продаётся бочками по 50 л), можно получить димерный флуорофор, вполне приемлемый для использования в тонких молекулярно-биологических экспериментах. Отсюда - вопросы: 1. Я прав или не прав? 2. Не найдётся ли желающих поэкспериментировать с подобными синтезами? Сам я от химии довольно далёк, но смогу обеспечить необходимую проверку качества красителей, а также посодействовать сбыту подобного продукта.

Дифенилметан Диизоцианат к хлопку (джинсам) пришивается ковалентно. Растворители не помогут. :(