Группа исследователей из Университета Висконсина определила 46 генов кишечной палочки , которые необходимы для ее выживания при исключительно высоких уровнях радиации. Статья появляется перед печатью в Журнале бактериологии .
«Исследование выявило новые пути самовосстановления клеток, в том числе пути ДНК, которые у людей могут помочь защитить нас от рака», - говорит автор-корреспондент Майкл М. Кокс.
Высокие дозы радиации смертельны не только для людей, растений и животных, но и для микробных клеток в целом. Тем не менее, некоторые бактерии, особенно Deinococcus radiodurans , обладают высокой устойчивостью к высокому уровню излучения. E. coli обычно не обладает такой радиационной устойчивостью, но устойчивые штаммы были разработаны путем воздействия на них повышенного уровня радиации и сбора выживших в каждом поколении.
46 генов возникли не в результате мутаций, созданных при высоких уровнях радиации, а скорее в результате генов, которые существуют в нормальной E. coli дикого типа . Результаты подтверждают представление о том, что выживаемость после высоких доз ионизирующего излучения не зависит от какого-то одного механизма или процесса, а, напротив, многогранна.
«Мы установили роль генов, участвующих в таких разнообразных процессах, как центральный метаболизм, синтез и поддержание клеточной стенки в радиационном выживании», - говорит Кокс. «Возможно, наиболее важным является то, что мы идентифицировали восемь генов с неизвестной функцией, которые играют существенную роль в радиационном выживании».
«Польза от этого исследования и его результатов может быть существенной», - говорит Кокс. «Наше понимание того, как клетки справляются с ионизирующим излучением, очень рудиментарно. Наша работа предоставляет расширенную карту клеточных функций, которые наиболее непосредственно участвуют в смягчении воздействия ионизирующего излучения. Оно выявило некоторые потенциально новые пути, с помощью которых клетки восстанавливают свою ДНК. и в более общем плане восстанавливают свои клеточные белки и другие компоненты после воздействия высоких уровней радиации ».
Один ген, функция которого ранее была неизвестна, играет роль в восстановлении двухцепочечных разрывов ДНК. «Этот ген связан с человеческим геном под названием XPB, и он может помочь выяснить некоторые ключевые пути восстановления ДНК у людей, которые помогают защитить нас от рака», - говорит Кокс.
Супероксиддисмутаза
Следуя антиоксидантному подходу к радиозащитной генной терапии, белки семейства супероксиддисмутазы (SOD) были тщательно изучены. Белки SOD представляют собой семейство из трех металлопротеинов, которые катализируют превращение супероксида (O 2 - ) в перекись водорода и кислород. Поскольку радиационное повреждение опосредовано образованием супероксида и других АФК в клетках, генная терапия SOD рассматривалась как средство уменьшения повреждений, вызванных XRT. Один член семейства, CuZnSOD (SOD1), локализуется в цитоплазме и конститутивно экспрессируется, в то время как MnSOD (SOD2) локализуется в митохондриях, и экспрессия индуцируется несколькими факторами, включая радиацию. 7Третий член семейства SOD, ECSOD (SOD3), также основан на CuZn, но локализован во внеклеточном пространстве. Несмотря на аналогичное ферментативное действие этих белков, MnSOD обычно проявляет превосходную радиозащитную способность. Считается, что это является результатом митохондриальной локализации MnSOD, поскольку MnSOD без последовательности митохондриальной локализации демонстрирует пониженную радиозащитную способность. 8 Точный механизм неизвестен, но возможно, что MnSOD ингибирует апоптоз, стабилизируя митохондриальную мембрану. 8Это свидетельство радиозащиты, опосредованной MnSOD, ставит под сомнение модель радиозащиты исключительно за счет антиоксидантных эффектов в цитоплазме клеток. С другой стороны, есть доказательства того, что ECSOD является потенциальным радиозащитным агентом в легких в силу его внеклеточной локализации. 9 Таким образом, возможно, что механизм радиозащиты через экспрессию SOD варьируется в зависимости от конкретной ткани, и для выяснения механизма радиозащиты SOD требуется дальнейшая работа. Помимо действия в качестве радиопротектора, есть доказательства того, что MnSOD действует как радиосенсибилизатор при некоторых видах рака 10 и нарушает регуляцию развития и прогрессирования опухоли. 11
Генная терапия супероксиддисмутазой проводилась с использованием различных векторов и способов введения для контроля локализации экспрессии. Векторы , используемые с СОДАМИ включают в себя рекомбинантные вирусы, 12 , 13 плазмидных липосом, 14 - 17 (. Плазмиды , в которой были устранены оставшиеся бактериальные последовательности) и minicircle-плазмида Липосома 18 Для достижения более конкретного выражения SOD, несколько методов были использованы для также применять эти векторы. Прямая инъекция использовалась для интратрахеальных 12 , 14 , 19 и внутрипищеводных 20 , 21 , 22защита. Внутривенное введение также использовалось для экспериментов по защите всего тела. 17 , 23 Эксперименты по радиозащите с помощью генной терапии SOD также проводились с использованием перорального введения плазмидных липосомных векторов. 24 , 25 И, наконец, плазмидные липосомы были введены в манере , что делает использование природной анатомической изоляции , такие как ингаляции через распылители 16 и внутрипузырную инстилляцию. 15
Генная терапия супероксиддисмутазой показала себя многообещающей в предотвращении радиационного поражения в некоторых тканях как на ранних, так и на поздних стадиях радиационного поражения. Было показано, что в легких терапия MnSOD снижает гистологические и клинические признаки организуемого альвеолита и фиброза, а также поздних последствий радиационного воздействия. 14 Этот защитный эффект, по-видимому, ограничен нормальными тканями без постороннего эффекта на опухолевых моделях. 26 Соответственно, введение генной терапии SOD снижает апоптоз в облученных легких 27 и снижает экспрессию воспалительных цитокинов IL-1, TNFα и TGF-β. 12 , 19В более поздние моменты времени введение генной терапии SOD приводит к снижению экспрессии VCAM-1 и ICAM-1, потенциально уменьшая иммиграцию лейкоцитов, которые способствуют легочному фиброзу. 28 год
Пищевод - еще одно место, которое широко изучалось в контексте радиозащиты генной терапии SOD. Было показано, что введение векторов для генной терапии MnSOD улучшает клинические маркеры на мышиных моделях после облучения, такие как уменьшение потери веса 21 и увеличение общей выживаемости. 20 Гистологически защитный эффект подтверждается данными об уменьшении образования вакуолей 20, увеличении выживаемости стволовых клеток боковой популяции 29 и повышенном приживлении клеток-предшественников костного мозга в поврежденной ткани пищевода. 30 Кроме того, применение генной терапии SOD связано со снижением перекисного окисления липидов 31и гомологичная рекомбинация в облученных тканях пищевода. 32
Генная терапия супероксиддисмутазой также перспективна для радиозащиты кроветворной ткани. Исследования in vitro с использованием линии миелоидных клеток мышей 32Dcl 3 показали, что генная терапия MnSOD снижает апоптоз этих клеток в ответ на облучение и TNFα. 33 Кроме того, введение генной терапии MnSOD снижает смертность от гемопоэтического синдрома in vivo. 34
Вместе эти исследования демонстрируют, что доставка генов членов семейства SOD, особенно MnSOD, является многообещающей стратегией радиозащиты различных тканей. Радиозащита, обеспечиваемая этой стратегией, была обнаружена с помощью клинических маркеров, таких как снижение потери веса и увеличение выживаемости, а также с помощью гистологических маркеров, таких как снижение апоптоза. Однако использование доставки гена SOD ограничено специфичностью доступных векторов доставки гена. Это ограничение привело к использованию прямой инъекции векторов SOD или введению в анатомически разделенные области, такие как мочевой пузырь, для достижения специфической экспрессии в тканях-мишенях. Чтобы обеспечить возможность использования радиозащиты SOD в других тканях при сохранении специфической доставки генов, необходимо разработать новые векторы, способные к усиленному нацеливанию.
Ученые исследовали белок Dsup, который связан с устойчивостью тихоходки Ramazzottius varieornatus к радиации, и выяснили, что он образует «кокон» вокруг нитей ее ДНК. Еще у одного вида тихоходок исследователи тоже нашли белок с аналогичным строением и функциями. В поисках похожих белков у других групп организмов они обнаружили, что некоторые участки белка Dsup напоминают белки HMGN, которые встречаются только у позвоночных, а у других животных их аналогов нет. Причины этого пока неясны, пишут ученые в журнале eLife.
Тихоходки известны своим умением впадать в ангидробиоз (то есть высыхать, а если точнее — «стекленеть») и переживать самые разные экстремальные условия: от перепадов температур до выхода в открытый космос. В частности, они способны выдержать до 1000 летальных для человека доз ионизирующего излучения.
В поисках секрета устойчивости тихоходок к радиации японские ученые расшифровали геном одного из видов — R. varieornatus — и обнаружили там ряд уникальных для этих животных генов. Один из них кодирует белок Dsup (от англ. damage suppressor, снижающий вред), а когда его ввели в клетки человека, оказалось, что они тоже могут приобрести дополнительную устойчивость к действию излучения: в их ДНК образовалось в два раза меньше разрывов. Поэтому исследователи заключили, что Dsup каким-то образом защищает ДНК от повреждений.
Об этом исследовании узнал американец Малаккар Вохрыжек (Malakkar Vohryzek), историю которого недавно рассказали журналисты STAT. Вохрыжек страдает гиперчувствительностью к ультрафиолету, поэтому каждый выход под открытое солнце приносит ему новые родинки, которые угрожают превратиться в меланомы. Вохрыжек воодушевился результатами японских ученых и решил, что Dsup может спасти его от болезни. Сейчас он рассылает письма ученым, биохакерам и биотехнологическим компаниям с просьбой отредактировать его геном и внести туда ген, который кодирует Dsup. Пока на его призывы никто не откликнулся, зато ученые из Калифорнии нашли чем-то похожие на Dsup белки в клетках человека.
Каролина Чавес (Carolina Chavez) и ее коллеги из Калифорнийского университета предположили, что Dsup выполняет свою защитную функцию, непосредственно связываясь с нитями ДНК. Чтобы это проверить, они смешали в растворе молекулы ДНК и Dsup, а затем проверили скорость их движения в геле: ДНК с Dsup «ползла» гораздо медленнее, чем чистая проба ДНК, а значит, вещества связались друг с другом. При этом Dsup взаимодействовал не только с «голой» ДНК, но и с ДНК в составе нуклеосом — в том виде, в котором она находится в клетках эукариот.
Затем исследователи решили проверить, есть ли похожие белки у других тихоходок. Они взяли для примера вид Hypsibius exemplaris, который тоже способен впадать в ангидробиоз. Два года назад его геном отсеквенировали и нашли там ген, который кодировал Dsup-подобный белок: 26,4 процента аминокислот у него оказались общими с Dsup. Ученые сравнили гены, которые кодируют Dsup и его аналог, и обнаружили, что рядом с ними в хромосомах у обоих видов расположены одни и те же гены. Аналог Dsup у H. exemplaris тоже оказался способен связывать ДНК, из чего авторы работы заключили, что эти два белка — ортологи, то есть обладают общими происхождением и функцией.
Далее ученые смоделировали «атаку» на ДНК в пробирке. Они добавляли ДНК в раствор, где шла реакция с выделением гидроксильных радикалов — химически активных веществ, которые образуются в клетках как под действием излучения, так и при окислительном стрессе. В тех пробах, куда добавляли еще и Dsup или его ортолог, разрывов в ДНК было значительно меньше, чем в тех, где защитных белков не оказалось. Таким образом исследователи подтвердили, что Dsup напрямую связывается с ДНК и защищает ее от радикалов.
Известно, что в составе белка Dsup много аминокислот серина, аланина, глицина и лизина. Эти аминокислоты мешают белковой нити сформировать плотный комок, и структура белка остается неупорядоченной. Поэтому ученые предположили, что Dsup обволакивает ДНК, как кокон, и защищает ее — как в высушенном состоянии, так и в растворе.
Наконец, исследователи решили проверить, есть ли аналогичные белки у других организмов. Они обнаружили похожую последовательность только в белках группы HMGN (high mobility group nucleosome-binding) — это регуляторные белки, которые встречаются только у позвоночных. Общим у Dsup и HMGN оказался участок, с помощью которого белки связываются с ДНК. Когда ученые удалили его из молекулы Dsup, белок тут же потерял свою активность и не смог защитить ДНК от гидроксильных радикалов.
Откуда у тихоходок и позвоночных взялся общий участок белка, которого нет у других групп организмов, пока неясно. Авторы работы не исключают, что это может быть результатом конвергенции, но вероятность такого события считают крайне малой.
Тем не менее, исследователи рассчитывают, что более подробное изучение свойств Dsup может помочь «усовершенствовать» клеточные культуры, чтобы те, например, легче переносили хранение и транспортировку и не накапливали повреждения в своей ДНК. О применении же в живых организмах — чего так хотелось бы Малаккару Вохрыжеку — речь пока не идет.
Тимофеев-Ресовский Н. В. и др. Введение в молекулярную радиобиологию. — 1981
Аминогрупы в α- и ε-положениях, можно обозначить αα, εε и εα.
Скорость реакции карбонильных соединений с аминокислотами растет с
увеличением температуры; при повышении температуры увеличивается также
концентрация люминесцирующего продукта, соответствующая равновесному
состоянию. Реакция протекает практически с одинаковой скоростью при pH= 11 и pH = 7,4,
но скорость ее существенно снижается в кислой среде (pH = 4).
Флюоресцирующие соединения обнаружены и при облучении микросомных мембран в суспензиях
в присутствии воздуха (γ-излучение 60Co, мощность дозы 20 Дж/кг в минуту) с
радиационно-химическим выходом, равным 0,026 мол/100 эВ (Мочалина А. С., 1979).
Можно предполагать, что обнаруженный флюоресцирующий продукт образовался в результате
реакции карбонильных соединений с фосфолипидами, содержащими в молекуле аминогруппу,
которые входят в состав макросомной мембраны.
Цепочка превращений гидроперекиси — карбонильные соединения —
сшивки, регистрируется при облучении клеток in vitro и in vivo.
РАДИОЛИЗ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ
Карбоновые кислоты, в молекуле которых имеется одна или несколько групп NH2, называются аминокислотами.
Известно около 180 различных природных аминокислот, 20 из которых являются стандартными стройблоками клетки.
Общий признак последних — группа глицила (Гл)—CH(NH2)COOH, в которой аминогруппа соединена с углеродным атомом,
соседним с углеродом карбоксила (α-углеродным атомом). Аминокислотный остаток Ra, присоединенный к глицилу,
определяет химическую индивидуальность соединения. В средах с различными pH аминокислоты как амфотерные
вещества могут находиться в различной ионной форме: катионной в кислой среде, цвиттерионной — в нейтральной,
вблизи изоэлектрической точки и в анионной форме в щелочной среде.
Химические формулы стандартных аминокислот,
а также их сокращенные названия даны в табл. 19, где они разбиты на 4 родственных по виду группы.
Рассмотрим общую схему радиолиза аминокислот, которая составлена на основании данных по радиолизу
двух простейших аминокислот глицина и аланина, систематизированных в обзоре Н. А. Дуженковой (1973).
В радиолизе аминокислот имеются общие черты, в какой-то мере сходные с теми, которые наблюдаются при
действии радиации на карбоновые кислоты. Специфика радиолиза аминокислот по сравнению с радиолизом карбоновых
кислот связана, в первую очередь, с наличием аминогруппы в молекуле (табл. 20, ср. с табл. 16).
При облучении аминокислот в кристаллическом состоянии в отсутствии кислорода преобразования
нестабильных продуктов 1-го поколения (Ак+, Ак* и e-) приводят в конечном итоге (см. табл. 20)
к различным вариантам диссоциации возбужденной молекулы (реакции 1а, б, в, г) или отрицательного
иона (реакции 3а, б, в). Из-за наличия аминогруппы образующиеся в результате диссоциации радикалы
разнообразнее по виду, чем радикалы карбоновых кислот. Многие из них зарегистрированы непосредственно,
с использованием метода ЭПР. Радикалы могут возникать в результате отщепления карбоксильной группы,
аминогруппы или атома водорода от α-углеродного атома, а также в аминокислотном остатке Ra
(большей частью путем отрыва H от углеродного атома).
Радикалы, возникающие в результате отщепления H (от а-углеродного атома или в остатке Ra),
образуются и при радиолизе водных растворов аминокислот в реакциях с H и OH (3г, д, е, ж, табл. 20).
Они регистрировались методом ЭПР при комнатной температуре в системах, в которые добавлялись вещества,
образующие при соединении с радикалом аминокислоты долгоживущие свободные радикалы. Под воздействием OH в
водных растворах из всех 18 исследовавшихся* стандартных аминокислот, за исключением глицина, в результате
отщепления H от углеродного атома аминокислотного остатка образуются радикалы вида NH3-CH(Ra)COO-.
Радикалы типа NH3-C(Ra)COO- зарегистрированы у 8 аминокислот: глицина, валина, лейцина, изолейцина,
1 В работе нет данных для цистеина и триптофана.
