Выделение уреазы из биологического материала

[ChrisGrey]

Ищу помощь от опытных биохимиков )
По заданию лабораторной работы нам нужно выделить уреазу из сухих дрожжей (полный текст работы в конце под катом). Выделение происходит в виде кристаллов, которые мы должны получить в ходе центрифугирования, но вся проблема в том, что даже после трёх актов центрифугирования и при 4 000 об/мин, и при пяти ничего не выпало, раствор как был прозрачным, так и оставался. Преподаватель предложил переделать работу и попробовать с "живыми" дрожжами, которые в брикетах, я предложил осадить уреазу тем же способом, что и любые другие белки - высаливанием сульфатом аммония. Но вся проблема в том, что я не знаю, каким образом очистить получившуюся смесь уреазы и соли. Профильтровать и диализ? А что, если осадить фермент спиртом, эфиром? Или вообще можно резко изменить pH (но тут я боюсь, что денатурация будет необратима).
В общем, пока будем переделывать работу с "живыми" дрожжами и думать над другими способами выделения уреазы, если не получится снова. Прошу подумать и вас 

 

500 мл 32%-го раствора ацетона нагревают на водяной бане до 28 C, после чего добавляют к нему 100 г. измельчённых сухих дрожжей). После тщательного перемешивания в течение 3-4 минут всю суспензию выливают в большую химическую воронку с быстрофильтрующим складчатым фильтром. После того, как соберётся около 150 мл фильтрата, переносят на ночь в холодовой шкаф и дальнейшую работу проводят на холоду.

Выпавшие кристаллы фермента отделяют центрифугированием и растворяют в 2-3 мл холодной дист. воды. Центрифугируют повторно и небольшой осадок отбрасывают. К центрифугату добавляют 0,5 объёма 5,0 М цитратного буфера (pH = 6,0) и затем (медленно и при помешивании) - холодный ацетон до конечной концентрации, равной 25%, после чего оставляют в холодильнике на ночь.
Выпавшие кристаллы собирают центрифугированием и высушивают лиофильно.
Активность уреазы определяют по кол-ву аммиака, образовавшегося из мочевины под действием фермента.
Навеску фермента растворяют в 0,5 М фосфатном буфере (pH = 7,0) с таким расчётом, чтобы при добавлении в инкубационную смесь 0,1 мл полученного р-ра образовывалось ок. 0,15 мг азота аммиака при нижеуказанных условиях измерения активности. Р-р фермента хранится на холоду не более суток.
В химические пробирки наливают по 0,5 мл р-ра мочевины и дист. воды с таким расчётом, чтобы общий объём пробы после добавления фермента составлял 1 мл. Пробирки помещают на 1 минуту в термостат при 37 С, после чего добавляют 0,05-0,15 мл р-ра уреазы и инкубируют в течение 5 минут. Реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 1 н соляной кис-ты. В кач-ве контроля на содержание NH4+ в реактивах используют пробы двух типов: в первой пробе вместо фермента содержится 0,5 М фосфатный буфер, во второй - вместо мочевины тот же буфер.
Для определения аммиака из опытных и контрольных проб отбирают по 0,15 мл, смешивают с 7 мл дист. воды, добавляют по 0,5 мл реактива Несслера и дист. водой доводят объём до 10 мл. Развившуюся окраску колориметрируют на ФЭКе с зелёным светофильтром против проб, содержащих 0,15 мл дист. воды вместо исслед. р-ра. Содержание аммиака рассчитывают по калибровочному графику. Для его построения используют 0,2-1 мл стандартного раствора соотв. аммонийной соли. Пробы для развития окраски обрабатывают, как указано выше. Результаты фотометрии изображают графически, откладывая по оси абсцисс кол-во аммиака в пробе, а по оси ординат - значения оптич. плотности.
Активность фермента выражают в нмолях NH4+, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчёте на 1 мг белка. Белок в пробе определяют по Лоури.

 

P.S. Вместо цитратного буфера использовали аналогичный фосфатный

Изменено 15 Апреля, 2015 в 15:45 пользователем ChrisGrey