Перейти к содержанию

Определение белков


Sinnerman

Рекомендуемые сообщения

Решение задач, рефераты, курсовые! Онлайн сервис помощи учащимся. Цены в 2-3 раза ниже!
Уже неделю ищу методику количественного определения белков на основе нингидриновой реакции. У кого-нибудь имеется таковая?

 

Спасибо громадное.

Могу сбросить Вам на E-mail методички

Ссылка на комментарий
Уже неделю ищу методику количественного определения белков на основе нингидриновой реакции. У кого-нибудь имеется таковая?

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

 

Как при выделении и очистке белков, так и при проведении разнообразных биохимических исследований необходимо количественное определение содержания белка в исследуемой фракции, в выделенном или исследуемом образце. Кроме того, анализ содержания белков в биологических жидкостях (крови) имеет важное биомедицинское значение и используется в диагностических целях. Количественное определение белка проводится, как правило, с небольшим количеством материала и требует высокочувствительных методов детекции.

Наиболее широко распространены колориметрические и спектрофотометрические методы количественного определения белка.

 

 

1.1. БИУРЕТОВЫЙ МЕТОД

 

Принцип метода. Метод основан на способности белков давать с раствором сернокислой меди фиолетовое окрашивание в щелочной среде. Для биуретовой реакции необходимо наличие двух ОН-групп и трех атомов азота, находящихся в полипептидной цепи. Группа, образующая пептидную связь (– ОС – NH –) в щелочной среде, присутствует в своей таутомерной форме. В избытке щелочи происходит диссоциация водорода енольной ОН-группы, при этом возникает отрицательный заряд, с помощью которого кислород, взаимодействуя с медью, образует соль; кроме того, медь образует дополнительные (дативные) связи с атомами азота пептидных связей. Возникший комплекс характеризуется высокой стабильностью.

Чувствительность данного метода позволяет определять белок в диапазоне концентраций от 2 до 10 мг в пробе.

 

Реактивы: 1. Раствор сывороточного альбумина, содержащий 10 мг белка в 1 мл (стандартный раствор).

2. Биуретовый реактив: 0,15 г СuSО4∙5Н2О и 0,6 г натрий-калия виннокислого (NаКС4Н4О6•4Н2О) растворяют в 50 мл Н2О, при энергичном перемешивании приливают 30 мл 10 % раствора NаОН, затем добавляют 0,1 г КI. Объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл. Реактив хранят в парафинированной или полиэтиленовой склянке в течение 1 мес.

 

Ход работы. Для построения калибровочного графика из стандартного раствора альбумина готовят растворы белка, содержащие 2, 4, 6, 8 и 10 мг альбумина в 1 мл. В каждую пробирку, содержащую 1 мл раствора белка соответствующего разведения добавляют 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют оптическую плотность раствора на ФЭК при 540 нм в 1 см кювете.

На каждую точку проводят два определения, для построения калибровочного графика используют среднее арифметическое.

Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику.

Ссылка на комментарий

Буду очень признателен. Биуретовая реакция не подходит. Дело в том, что наша система представлена различными динамическими процессами гидролиза белка ферментами с образованием пептидов различной длины. Биуретовая реакция по пептидным связям не даст нам нужной точности. Хотелось бы опробовать нингидрин.

Ссылка на комментарий

Для публикации сообщений создайте учётную запись или авторизуйтесь

Вы должны быть пользователем, чтобы оставить комментарий

Создать учетную запись

Зарегистрируйте новую учётную запись в нашем сообществе. Это очень просто!

Регистрация нового пользователя

Войти

Уже есть аккаунт? Войти в систему.

Войти
  • Последние посетители   0 пользователей онлайн

    • Ни одного зарегистрированного пользователя не просматривает данную страницу
×
×
  • Создать...
Яндекс.Метрика