Витамин K2 MK 7

[Malika76]

Была такая ситуация, обратился ко мне один деятель с просьбой синтезировать витамин  K2 MK 7 Cas № 2124-57-4

предлагал за 100 г готового продукта 10 000 $ и говорил что может покупать постоянно от 100 до 300 г в месяц.

Что за лажа такая - глянула у китайцев - оно меньше 1000 долларов за кг продают, это что за придурок ко мне обращался, подстава какая или чел просто с головой не дружен ?

Какова реальная цена препарата на рынке, может кто знает?

Глянула синтез по патентам - там 7 стадий и оборудование злоебучее надо, хотя есть вариант выделения из природного сырья .....

 

 

[Эрик697]

В 08.02.2025 в 11:17, Malika76 сказал:

Была такая ситуация, обратился ко мне один деятель с просьбой синтезировать витамин  K2 MK 7 Cas № 2124-57-4

предлагал за 100 г готового продукта 10 000 $ и говорил что может покупать постоянно от 100 до 300 г в месяц.

Что за лажа такая - глянула у китайцев - оно меньше 1000 долларов за кг продают, это что за придурок ко мне обращался, подстава какая или чел просто с головой не дружен ?

Какова реальная цена препарата на рынке, может кто знает?

Глянула синтез по патентам - там 7 стадий и оборудование злоебучее надо, хотя есть вариант выделения из природного сырья .....

 

 

У господина Ли Си Цена поставка разовая, 2доставка уже будет с немытого реактора. Видно деятель уже эту тему проработал с аналогичным результатом. Недавно вел переговоры с China по ремуверу пластика, они мне тоже на нормальном английском предлагали на водной основе салфеточками смывать. Сейчас гляну что за 7стадий.

[Эрик697]

раз нужна ешерихия, то это быстрее 7стадий, вопрос в 1)правильной ее генной модификации, 2)чем кормить, 3)деградация популяции на 2цикле

Аннотация

Менахинон-7 (MK-7), высоко ценный представитель серии витаминов К2, является важным питательным веществом для человека. В этом исследовании для разработки модифицированных штаммов Escherichia coli для производства MK-7 была введена гетерогенная гептапренилпирофосфатсинтетаза (HepPPS), и выработка MK-7 впервые была достигнута в модифицированной E. coli путем сверхэкспрессии HepPPS, полученных из Bacillus subtilis (BsHepPPS). Затем, за счет оптимизации экспрессии ферментов пути гетерогенной мевалоновой кислоты (MVA) и BsHepPPS, титр MK-7 увеличился до 2,3 мкм, что в 22 раза выше, чем у исходного штамма. Конкурентные пути MK-7 были дополнительно исследованы путем делеции UBiCA или ispB. Наконец, была исследована масштабная ферментация искусственной кишечной палочки в 5-литровом ферментере в аэробных условиях с использованием глюкозы, и было получено 13,6 мкм (8,8 мг/л) МК-7. Кроме того, анализ метаболитов выявил новое узкое место в пути MK-7 в ubiE, что указывает на пути дальнейшей оптимизации. В этом отчете впервые описывается метаболическая инженерия МК-7 в кишечной палочке, которая открывает новые перспективы для производства МК-7.

Ключевые слова: Искусственная кишечная палочка; гептапренилпирофосфатсинтетаза; Менахинон-7; Путь мевалоновой кислоты.

[Эрик697]

если найдете чем витамин подсветить на тсх хроматограмме, или в самом субстрате, то возможно добавка красителей ускорит процесс естественно искусственного отбора

[Эрик697]

 Традиционный японский пищевой продукт натто, который производится из соевых бобов, ферментированных Bacillus subtilis natto, содержит МК-7 в очень высокой концентрации

[Malika76]

Таки тогда можно экстрагировать

У меня вообще была мысль просто у китайцев взять готовый, почистить и в свою упаковку захерачить, только вот что оно столько стоить может как предлагали сомнительно

[Эрик697]

В 08.02.2025 в 13:07, Malika76 сказал:

Таки тогда можно экстрагировать

нужен аптечный эталон, тогда после тсх будет однозначно понятно оно или нет и сколько его

если бобы не до конца прожаренные, может что заспорованное найдется для вторичного выращивания

[Malika76]

как я понимаю его нет - это не фарм препарат, а лажа для лохов

[Эрик697]

Менахиноны, экстрагированные с использованием нового метода лизоцим-хлороформ-метанол (LCM), были сопоставимы по качеству с теми, которые были получены с использованием метода Коллинза, наиболее широко используемого метода. 

Химикаты и реагенты

Все реагенты и растворители, использованные при экстракции, были аналитического качества. Штаммы инкубировали в среде 2216E (рН 7,4~7,6), которая состояла из 5,0 г/л пептона, 1,0 г/л дрожжевого экстракта, 0,1 г/л FeC₆H₅O₇, 19,45 г/л NaCl, 5,98 г/л MgCl₂, 3,24 г/л Na₂SO₄, 1,8 г/л CaCl₂, 0,55 г/л KCl, 0,16 г/л Na₂CO₃, 0,08 г/л KBr, 0,034 г/л SrCl₂, 0,022 г/л H₃BO₃, 0,004 г/л Na₂SiO₃, 0,0024 г/л NaF, 0,0016 г/л NH₄NO₃ и 0,008 г/л Na₂HPO₃. Лизоцим (Solarbio Science & Technology, Пекин, Китай) использовался для расщепления клеточной стенки. Для экстракции МК использовали трис-HCl буфер (10 мМ, рН 7,4), хлороформ-метанол (2:1 по объему) и гександиэтиловый эфир (85:15 по объему). Эти органические реагенты были приобретены у Xilong Scientific Co., Ltd., Гуанчжоу, Китай. Стандарт MK-9 был приобретен у GLPBIO, Монклер, Калифорния, США. Масс-спектрометрический метанол (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и изопропанол (Fisher Chemical, Thermo-Fisher Scientific Inc.) использовались для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) и масс-спектрометра (MS).

Штаммы для анализа на менахинон

Microbacterium yannicii JCM 18959^T, Microbacterium ginsengiterrae JCM 15516^T, Brachybacterium squillarum JCM 16464^T, Nesterenkonia halobia JCM 15475^T, Chryseoglobus frigidaquae JCM 14730 , Brevibacterium linens JCM 1327^T, Yonghaparkia alkaliphila JCM 15138^T и Janibacter melonis JCM 16063^T были приобретены в Японской коллекции микроорганизмов (JCM). Streptomyces indicus MCCC 1A03308^T был приобретен в Коллекции морских культур Китая (MCCC). Microbacterium hibisci CCTCC AB 2016180^T был приобретен в Китайском центре сбора типовых культур (CCTCC). Микробактерии. растворители уреи CFH S00084^T были предоставлены Го-Син Не, Колледж рыбного хозяйства Хэнаньского педагогического университета, Китай. Saccharopolyspora coralli E2A^T, Georgenia subflava Y32^T, Microbacterium sp. NY27, Microbacterium sp. A18JL200 и Brevibacterium sp. O2 был выделен нашей лабораторией.

Оборудование

Пробирки и 1-литровые колбы Эрленмейера использовались для культивирования семян и ферментации штаммов. Сбор клеток и экстракцию МК проводили с помощью центрифужных пробирок объемом 50 мл (Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, Китай) и центрифуги Eppendorf 5804R (Eppendorf China Co., Ltd.). Расщепление лизоцима проводили на электростатической водяной бане (YiHeng technical Co., Ltd., Шанхай, Китай). Экстрагированные МК высушивали с помощью роторного испарителя (Heidolph Instruments GmbH & CO. KG). Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили с использованием слоев силикагеля HF₂₅₄ толщиной 0,4-0,5 мм (10×10 см) и стеклянной емкости для проявки (Jiangyou Silica gel Development Co., Ltd., Яньтай, Китай). МК наблюдали под ультрафиолетовым излучением с помощью УФ-анализатора (Chi Tang Industrial Co., Ltd., Китай). Органический растворитель фильтровали с помощью шприцев объемом 2 мл (Kangyou Medical Equipment Co., Ltd., Цзянсу, Китай) и нейлоновых шприцевых фильтров 0,22 мкм/13 мм (Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, Китай). Образцы вводили в систему ВЭЖХ (Waters Alliance e2695) и систему Waters ACQUITY UPLC® из 2-мл янтарных флаконов с автопробами с завинчивающейся крышкой (Thermo-Fisher Scientific Inc.). Система ВЭЖХ была оснащена детектором 2998 PDA и колонкой SunFire™ C18 (5 мкм, 4,6 × 150 мм). Система UPLC была оснащена колонкой с обращенной фазой C18 (1,7 мкм 2,1 × 50 мм, ACQUITY UPLC® BEH C18), eλ-детектором PDA и MS с высоким разрешением (Xevo G2 Q-TOF с электрораспылительной ионизацией (ESI)).

Культивирование и сбор штаммов

Все штаммы, использованные в этом исследовании, культивировали на чашках с агаром 2216E. Одну колонию инкубировали в пробирке, содержащей 5 мл среды 2216E, при 28°C при встряхивании со скоростью 150 об/мин до достижения оптической плотности (OD при 600 нм) 0,6. Затем 2 мл семенной культуры добавляли в 200 мл среды 2216E в 1-литровых колбах Эрленмейера и инкубировали 3-4 дня во вращающемся шейкере при 150 об/мин и 28°C. Клетки разделяли на две равные части для различных методов экстракции МК, а затем собирали в центрифужные пробирки объемом 50 мл с использованием центрифуги Eppendorf 5804R при 6000×g в течение 15 минут. Были проведены три независимых повторных культивирования и сбора штамма.

Метод экстракции лизоцимом,хлороформом и метанолом

Поскольку толстая клеточная стенка актиномицетов может противостоять экстракции органическим растворителем, для экстракции MKS был использован улучшенный метод, названный лизоцим-хлороформ-метанолом (LCM). Для этого метода использовали лизоцим для разрушения клеточных стенок с последующей экстракцией хлороформом-метанолом (2:1 по объему). После концентрирования с помощью роторного испарителя и очистки с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) МК наблюдали с помощью УФ-анализатора при 254 нм и элюировали изопропанолом. В этом исследовании для метода LCM было проведено три повторения.

Этапы экстракции были следующими:

1. 1.

   Для каждого штамма получали влажную клеточную массу (0,7–1,0 г), как описано выше.

2. 2.

   Клетки дважды промывали 20 мл 10 мМ трис-HCl буфера (рН 7,4), чтобы избежать загрязнения среды, а затем их суспендировали в 50 мл 10 мМ Трис-HCl буфера (рН 7,4) с 50 мг лизоцима. Раствор хорошо перемешивали путем измельчения в течение 1 мин и инкубировали на водяной бане при температуре 37°C в течение 1 ч (с 1-минутным встряхиванием каждые 10 мин) для расщепления клеточной стенки. Затем смесь центрифугировали в течение 15 мин при 6000×g для сбора клеток, обработанных лизоцимом. (Примечание: клеточные стенки некоторых актиномицетов легко перевариваются лизоцимом, образуя коллоидный раствор, который трудно центрифугировать; таким образом, важен следующий этап удаления воды.)

3. 3.

   Обработанные лизоцимом клетки промывали 5 мл метанола (или этанола) для удаления воды. Метанол (или этанол) следует отобрать, поскольку он может растворить некоторое количество МК. (Примечание: для легко перевариваемых актиномицетов после центрифугирования удалите как можно больше воды, а затем добавьте равный объем метанола (или этанола) к оставшемуся раствору. Несколько раз встряхните, а затем центрифугируйте в течение 15 мин при 6000 × g. Затем клетки можно собрать и промыть 5 мл метанола (или этанола). Также следует собрать верхний водно-метанольный раствор.)

4. 4.

   К клеткам добавляли хлороформ/метанол (10 мл, 2:1 по объему) и затем встряхивали в течение 1 мин для извлечения MKS. Экстракцию хлороформом-метанолом повторяли три раза. Было получено примерно 30 мл неочищенного экстракта.

5. 5.

   Метанольный (или этанольный) и хлороформно-метанольный экстракты собирали и сушили с помощью роторного испарителя при 35°C. Затем сухой продукт три-четыре раза растворяли в 500 мкл хлороформ-метанола (2:1 по объему).

6. 6.

   Растворенный в хлороформе и метаноле неочищенный экстракт очищали методом ТСХ, который проводили с использованием слоев силикагеля HF₂₅₄ толщиной 0,4-0,5 мм (10×10 см) и проявляющего растворителя, состоящего из гексана/диэтилового эфира (85:15 по объему). МК обычно обнаруживаются с помощью ТСХ с использованием кратковременного облучения коротковолновым ультрафиолетовым светом (254 нм). В этой системе МК мигрируют примерно с Rf ≈ 0,7. Полосу MK собирали и элюировали с использованием 1,5 мл изопропанола.

7. 7.

   Элюированные изопропанолом МК фильтровали с помощью нейлоновых шприц-фильтров 0,22 мкм в 2-мл флаконы с автопробами янтарного цвета с завинчивающейся крышкой и затем исследовали методом UPLC-UV/MS или ВЭЖХ-UV/MS

[Эрик697]