Синтез метилазидных линкеров для модификации dNTP

[genseq]

В этом году в США стартовала программа, нацеленная на секвенирование миллиона геномов американцев, а в Китае собираются "замутить" проект по секвенированию ста миллионов Китайцев. Причём во всех подобных проектах используется флуоресцентная технология компании Illumina, основанная на синтетических дНТФ с флуорофорами, присоединёнными к основаниям через азид-содержащий линкер, да ещё и с метилазидной блокировкой 3'-OH группы у дезоксирибозы. С непривычки звучит страшновато, но если посмотрите в патентах способы синтеза азидных линкеров, то станет ещё страшнее.

 

Для России секвенирование народонаселения является непозволительной роскошью из-за дороговизны расходных реагентов, т.е. этих самых модифицированных дНТФ. Модифицировать нуклеотиды способны 3...4 группы отечественных химиков, но для начала было бы неплохо освоить синтез азидных линкеров. Причём главное в этом деле не столько синтез требуемого соединения, сколько разработка простейшего варианта его синтеза. Или даже просто теоретическая проработка этого вопроса (показывающая, что "не так страшен чёрт, как его малюют").

На рисунке показана общая структура модифицированного дНТФ. Выделены азидные группы, восстановление которых (фосфинами, меркаптоэтанолом и т.п.) приводит к удалению флуорофора и высвобождению блокированного 3'-OH конца дезоксирибозы.

Посадить на 3'-конец метилазидный блокатор (AZM) не слишком сложно. Это было освоено ещё в прошлом веке Завгородним (ИБХ РАН). Не меченые трифосфаты такого типа даже имеются в продаже:

https://azcobiotech.com/reagents/pcr-sequencing-reagents/3-azm/

Есть в продаже и флуорофоры с различными функциональными группами, и аминоаллильные производные трифосфатов, к которым можно "пришивать" флуорофоры. А вот линкеры для такой пришивки отсутствуют.

Отсюда - вопрос: нельзя ли как-нибудь попроще синтезировать требуемые линкеры?

 

Сам в синтезах не разбираюсь, так что если что-то и придумаю, то, скорее всего, окажется глупостью.

Буду признателен за любые вопросы, предложения и соображения.  

[ZaecЪ]

А чем вам не по нраву методики описанные в патентах, номера которых указаны на рисунках соответствующих соединений?!

[s324]

Модифицировать нуклеотиды способны 3...4 группы отечественных химиков,

гы-гы!

делать подобного рода химию могут разные группы.

НО!

для такой работы требуются капитальные вложения.

и тут внимание самое главное - они уже известны! допустим х $.

спрашивают наших вы готовы это делать

да! цена 3-5х !

ответ

-нафик с пляжа!

[genseq]

А чем вам не по нраву методики описанные в патентах, номера которых указаны на рисунках соответствующих соединений?!

Наверное тем, что для меня такой синтез кажется слишком сложным. Насчитывает 6 стадий. И используется много реагентов, которые нельзя купить в аптеке.

 

Вот выписка из патента:

https://yadi.sk/i/aZSyg5L6uaFg8

[s324]

в аптеке )))

[genseq]

в аптеке )))

Насчёт аптеки - это шутка. Но в каждой шутке есть только доля шутки. Например, для замещения брома азидом лучше использовать не азид натрия, а азид лития. Хотя литий можно добавить в качестве катализатора реакции к натриевой соли. Наверное, подойдёт и карбонат лития, который в аптеках имеется. Там же есть и йодоформ. Его-то уж точно проще всего купить в аптеке. Если заместить один атом йода азидом, а второй - молочной кислотой (тоже продаётся в аптеках), то останется что-то придумать с третьим. Или использовать его напрямую для соединения с торчащим из основания аллиламином. Правда, флуорофор придётся "навешивать" через карбоксильную группу, но это не самая сложная задача. Проблема в том, что линкер должен быть длинным и гибким. Т.е. желательно встроить в него не меньше двух молекул этиленгликоля. А лучше диэтиленгликоля.

[dxdydz]

Насчёт аптеки - это шутка. Но в каждой шутке есть только доля шутки. Например, для замещения брома азидом лучше использовать не азид натрия, а азид лития. Хотя литий можно добавить в качестве катализатора реакции к натриевой соли. Наверное, подойдёт и карбонат лития, который в аптеках имеется. Там же есть и йодоформ. Его-то уж точно проще всего купить в аптеке. Если заместить один атом йода азидом, а второй - молочной кислотой (тоже продаётся в аптеках), то останется что-то придумать с третьим. Или использовать его напрямую для соединения с торчащим из основания аллиламином. Правда, флуорофор придётся "навешивать" через карбоксильную группу, но это не самая сложная задача. Проблема в том, что линкер должен быть длинным и гибким. Т.е. желательно встроить в него не меньше двух молекул этиленгликоля. А лучше диэтиленгликоля.

а можно про азид лития по подробнее, где о таком пишут?

[Berzelius]

 

genseq, ответьте пожалуйста на мое письмо которое я отправил Вам в ЛС

 

[genseq]

genseq, ответьте пожалуйста на мое письмо которое я отправил Вам в ЛС

Извините, не получал. Да и оповещения об ответах в этой теме что-то не приходят. Наверное, не разобрался с настройками и что-то напутал. 

Напишите ещё раз напрямую - genseq(at)mail.ru

а можно про азид лития по подробнее, где о таком пишут?

Например, здесь. Правда, Иллюминовцы в синтезах литий не упоминают. Используют натриевую соль.

zavgorodny2000.pdf

 

Кстати, о синтезе азидных линкеров. Наука не стоит на месте:

Iodine-Catalyzed Three-Component Reaction_2009.pdf

Похоже, можно уложиться в одну стадию, если использовать катализируемую йодом трёхкомпонентную реакцию этиленгликоля (спирт), глутарового альдегида и триметилсилилазида в дихлорметане (с избытком альдегида). А концевые альдегидные группы окислить до карбоксильных добавлением водного раствора карбоната натрия (т.е. использовать для окисления имеющийся там йод с переводом продуктов в водную фазу). И очистить от глутаровой кислоты и прочих примесей хроматографией.

 

Что скажут специалисты?

Изменено 2 Сентября, 2016 в 18:13 пользователем genseq