Нерастворимые протеины

[Lyussy]

Здравствуйте!

Есть ли у кого опыт с очисткой нерастворимых протеинов?

[Angry_Biotechnologist]

3 часа назад, Lyussy сказал:

Здравствуйте!

Есть ли у кого опыт с очисткой нерастворимых протеинов?

Добрый день,

Вам нужен HIC https://www.bio-rad.com/en-cz/applications-technologies/introduction-hydrophobic-interaction-chromatography-hic?ID=MWHB53MNI

[Lyussy]

Правда, работа не с НIC, a с NiNTA-Affinity Chromatography. Тут не посоветуете что-нибудь?

[Angry_Biotechnologist]

14 минут назад, Lyussy сказал:

Правда, работа не с НIC, a с NiNTA-Affinity Chromatography. Тут не посоветуете что-нибудь?

Так у вас должен быть тег полигистидиновый - он цепляется за метал (в вашем случае - никель). Тут два видео - первое, работа в практике, второе - теория.

 

 

 

[Lyussy]

Да, конечно, я знакома с теорией и знаю, что мой протеин имеет гексагистидиновый тег, но я пока не знаю, как выделить этот протеин из мертвых бактерий, не знаю, в чем его растворить, чтобы был потом большой выход в хроматографии. Поскольку протеин нерастворим, он остается после центрифугирования в осадке вместе с кучей другого "барахла". Вот что прибавить к этому "барахлу", чтобы после центрифугирования протеин плавал в жидкости?

[Angry_Biotechnologist]

18 часов назад, Lyussy сказал:

Да, конечно, я знакома с теорией и знаю, что мой протеин имеет гексагистидиновый тег, но я пока не знаю, как выделить этот протеин из мертвых бактерий, не знаю, в чем его растворить, чтобы был потом большой выход в хроматографии. Поскольку протеин нерастворим, он остается после центрифугирования в осадке вместе с кучей другого "барахла". Вот что прибавить к этому "барахлу", чтобы после центрифугирования протеин плавал в жидкости?

Это мембранный белок как я понимаю? Для них можна использовать ещё такой тег https://cube-biotech.com/what-is-rho1d4-an-affinity-tag-specialized-for-membrane-proteins

Надо дать какие-то нейонные детергенты (типа tween или октил глюкозид, можно даже мягче DM, DDM, L-MNG, GDN - что-бы выхлоп функционального белка был выше) + стабилизирующий агент (сахароза или глицерин).

Вот интересная публикация на тему: https://www.researchgate.net/publication/264049754_Expression_solubilisation_and_purification_of_a_functional_CMP-sialic_acid_transporter_in_Pichia_pastoris

 

Какой именно детергент - тут уже сами смотрите, так как каждый белок ведет себя чучуть по разному в разных детергентах.

[Lyussy]

4 часа назад, Angry_Biotechnologist сказал:

Это мембранный белок как я понимаю?

Нет, это внутри в бактерии (энзим).

[Angry_Biotechnologist]

21 час назад, Lyussy сказал:

Нет, это внутри в бактерии (энзим).

тогда мягкий детергент с стабилизатором Напишите потом как прошло - успешно или нет

[Lyussy]

A какой стабилизатор бы Вы посоветовали?

Насчет детергента. Urea оказалась недостаточной, поэтому хочу попробовать GuanidiniumHydrochlorid.

[Angry_Biotechnologist]

3 минуты назад, Lyussy сказал:

A какой стабилизатор бы Вы посоветовали?

Насчет детергента. Urea оказалась недостаточной, поэтому хочу попробовать GuanidiniumHydrochlorid.

сахарозу наверное, to play safe как говорится. Но тоже смотрите по ситуации, может не подойти - тогда глицерин. Если и глицерин не пойдет то можно что-то специфическое посмотреть.

С гуанидином внимание - сильный хаотроп