определение концентрации никотина в водной вытяжке

[Sona_seg]

Добрый день всем!
подскажите, пожалуйста, как определить концентрацию никотина в многокомпонентной водной вытяжке (вытяжка из сигаретного табака).
имеем: вытяжки различной "крепости" и предположение, что концентрация никотина в них увеличивается с увеличением исходного количества табака (при одинаковом объеме, естественно).
не имеем: спектромасса, газового хроматографа и четкого представления о том, как это количественно подтвердить    
в нете нашла несколько "подходящих" методов, но, как всегда, с кучей вопросов по ним...
спектрофотометрический метод (ГОСТ 30038-93, ГОСТ 30438-2003), но в этих описаниях используются не водные вытяжки, а, кроме того, моих математических ЗУН не достаточно, чтобы понять как из исходного количества реактивов (по max: 2 г навески табака, 25 см3 воды, 40 г NaCl и 5 см3 NaOH) получить 220-250 см3 дистилята. 
есть статья с водным экстрактом (Н. Сафаров и др. Извлечение никотина из табака и его концентрация. Известия ВУЗов. Пищевая технология, №4-5, 1997. с. 80-81), но нет колонны с кольцами Рашига   
и, наконец, са-а-амый простой и подходящий вариант - определение по изменению рН при реакции никотина с серной кислотой с образованием никотин сульфата. но здесь больше всего вопросов:
1. вытяжка многокомпонентная с неизвестным толком качественно-количественным составом. значит на начальную и конечную рН будет оказывать влияние не только никотин (основание).
2. не смогла найти точного значения рН для никотин-сульфата. по данным первоисточника "рН примерно 5-6". но 5 и 6 - это две большие разницы, от 5 до 6 можно титровать и титровать.
3. вытяжка многокомпонентная (в первоисточнике попроще жидкость для заправки е-сигарет) и серная кислота, вероятнее всего, будет взаимодействовать и с другими компонентами. 
вот, как-то так... идеального метода я не нашла. можно, конечно, попробовать создать химеру (экстракция одним методом, отгонка - другим, определение - третьим), но я не совсем уверена в своих силах и адекватности последующих результатов.
может быть есть более простые решения с нехитрым набором реактивов и оборудования. буду благодарна за любые советы и комменты.

[chemist-sib]

Доброго времени суток, Sona_seg. Я бы попробовал решить эту проблему следующим образом: никотин - один из основных компонентов сигаретного табака, имеющий достаточно характерный УФ-спектр поглощения (как и другие производные пиридина) и, главное - весьма интенсивный! Вот именно его интенсивность и позволяет мне предположить, что даже без предварительного выделения никотина (типа, дистилляцией из щелочной среды) из матрицы, работая просто с кислой водной вытяжкой (банальной 0,1 н солянкой!) и устраняя мешающие влияния (ибо соэкстрактивные вещества там обязательно будут!) разбавлением этого экстракта, можно будет "сварганить" простой и достаточно точный (последнее - пока ИМХО!) метод. Заглянул сейчас в монографию Кларка (Clarke`s Analisis of Drugs and Poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmorten material. Fourth edition. London-Chicago, Pharmaceutical Press, 2011.  А 1-е издание было в 1969 году. "Библия" судебных токсикологов всего мира)  - для кислого раствора (0,1 н солянка) никотина - максимум полосы поглощения - 259 нм (и справа, и слева от него - по "ступенечке"), удельный коэффициент поглощения для этого максимума - 338. Для подтверждения того, что по результатам прямых измерений Вы можете считать концентрацию, можно (а для начала - даже нужно) будет снять саму картинку полностью, сравнив ее со спектром чистого никотина (из литературы, того же Кларка) или метчика-свидетеля, затем, подщелочив, еще раз снять спектр: для производных пиридина "картинка" чуть сдвигается и меняется по интенсивности (и опять сравнить ее с тем, что должно быть). А далее - настаивание точной навески листа с 0,1 н солянкой (думаю, нескольких часов вполне хватит; можно оставить на ночь), доведение до точного объема, фильтрование, разбавление, СФМ. На тот случай, если прямое УФ-СФМ-определение не сработает (мало в это верю, но - вдруг!..) - действительно, возможно создание "химеры" - с выделением никотина (спасибо летучести его основания!). Дистилляция из щелочной водной взвеси измельченного табачного листа (простая ли, с водяным паром; добавление электролитов (солей) - из разряда "кашу маслом не испортишь"); дистиллят поглощать в 0.1 н солянку, до точного объема, потом - разбавление (до измеряемых показаний) и расчеты. Вроде бы - ФСЕ!.. Удачи!    

[Sona_seg]

Спасибо большущее, chemist-sib, за советы и подробные выкладки! просто руководство к действию для умелого химика, но... вы имеете дело с биологом (так уж вышло  ), поэтому до действий пока не дошло... тем не менее, благодаря Вашим комментам, пазл начинает потихоньку складываться   . есть у меня несколько уточнений и, конечно, вопросов, и я буду очень благодарна, если Вы найдете время (и желание, конечно) на них ответить  .

1. по поводу вытяжки: имеет место токсикологический эксперимент и необходимо определить концентрацию, вернее концентрации, именно водных вытяжек, отличающихся различной исходной массой табака. т.е. вытяжка готовится, фильтруется,а уж потом с ней можно делать что угодно (если добавить реактивы, скажем щелочь и NaCl, сразу, это может повлиять на степень экстракции никотина).

если я правильно поняла, после того, как я получила фильтрат, вытяжку нужно подкислить 0,1 н. соляной кислотой (наверное, 2-3 мл на 50 мл вытяжки, для "чифирных" вытяжек - мл 5, или это соотношение больше подходит для перегонки никотина с водяным паром, а для спектрофотометра нужен больший объем кислоты ?).

а что у нас в растворе в итоге? никотин-сульфат? и для него "максимум полосы поглощения - 259 нм, удельный коэффициент поглощения для этого максимума - 338"? 

2. поскольку с контролем (чистый никотин) напряженка, придется сравнивать с литературными,таки да, данными. сравнивать нужно со спектром чистого никотина или никотин-сульфата (или имеется ввиду как раз чистый никотин в соляной кислоте?).

3. и, наконец, расчет концентрации будем проводить по формуле: с=опт.плотность/ уд.коэф.погл.*толщина поглощающего слоя (опт. длина кюветы)? 

ну все, надеюсь не напутала совсем уж... Вы простите за такой шквал, наверное "примитивных" вопросов, но учитывая мое темное биологическое прошлое (и настоящее  ) и отсутствие опыта в спектрофотометрии, очень нужна помощь специалиста.

[chemist-sib]

Ладно, как в том старом анекдоте - "...а я расскажу еще один раз..."    Правда, мне не трудно!..

1. Только сразу же - уточните: вам в качестве объекта исследования важен сам лист табака, или уже водная вытяжка из него? Т.е., что - первоначальное? В принципе, никотин в растительном сырье находится в ионизованной форме, в виде солей с органическими кислотами - в водорастворимом виде. И даже нейтральной водой он должен вполне количественно выделяться оттуда. Но если экстрагировать его слабым кислым водным раствором, то это уже - наверняка, с гарантией! И еще одно "телодвижение" - опять же - чтоб "с гарантией!": двух-трех-кратное извлечение. Т.е., залили, настояли, слили, залили свежей порцией экстрагента, настояли, слили, еще раз... Экстракты объединили, профильтровали, довели до точного объема.. Все - по законам диффузии... Кстати, в качестве экспериментального подтверждения и обоснования выбора - что и как делать - можете сделать сравнительную серию экспериментов: экстракция из табака просто водой (однократно, двух-, трех-кратно), экстракция 0,1 н солянкой (однократно, двух-,трех-кратно). Выбираете тот вариант, который обеспечивает вам максимальный выход аналита, но "без излишнего фанатизма"! - т.е., это обычный вариант "задачи на оптимум". Если же у вас первоначально - уже готовая вытяжка - правда, здесь остается "в тени" коэффициент экстракции - да, подкисляете уже ее. Спектральные данные в Кларке приводятся для "стандартных" растворов. Для кислых это - 0,1 н солянка. Т.е., ваш фотометрируемый раствор должен быть более-менее близок по кислотности в этому "стандарту" (и раствору сравнения, конечно же). Я думаю, это будет выглядеть чуть иначе, чем вы написали: скажем, ...2-3 мл этой водной вытяжки - до 100-200 мл 0,1 н солянкой. Скорее всего, и этого будет мало, но чтобы не лить зазря реактивы - сделайте ступенчатое разбавление: ё-1 мл вытяжки - до 25-50 мл солянкой, потом из этой мерной колбочки - 2-3-5... мл - в другую - до 50-100... мл. Разбавлять до такой степени, чтобы оптическая плотность в интересующем вас (нас   ) диапазоне была "божеской", скажем, на уровне 0,4-0,8 е.о.п. 

2. Понимаю, что со склянкой, на которой надписано "Никотин-сульфат. чда", да еще и паспорт качества имеется - возможны напряженки, но ведь можно почистить вытяжку из того же табака на пластинке и снять с нее пятно чистого никотина, и снять его спектры. Можно и на картинки в литературе ориентироваться - т.е., показать, что то, что вы рисуете в своей работе и по чему считаете - и по виду, и по отношениям плотностей в максимумах-минимумах - не очень отличаются от таковых картинок для чистого аналита. Т.е., что у вас нет существенных погрешностей из-за соэкстрактивных веществ (а они здесь обазятельно будут и точно так же тоже будут как-то поглощать УФ...). Но все, вообще-то, зависит от того, какого уровня работу вы делаете, и кому это потом будете презентовать. Удовлетворение интереса  друга, попросившего посмотреть - сколько никотина он заливает в свой домашний кальян - это одно, диссертационная работа, предоставляемая в серьезный Совет - это уже другое... 

В растворе у нас - никотин ионизованный, в виде соли. По большому счету, неважно - никотин-сульфат, или никотин-гидрохлорид (это - если анион тоже "оптически неактивный"). Как правило, коэффициенты поглощения в подобной литературе даются в пересчете на алкалоид-основание.

3. Да, расчет концентрации проводится именно по этой формуле - "основному закону фотометрии". Только учтите, что удельный коэффициент поглощения дан для концентрации, выражаемой в следующей единице измерения - г/100мл. Не запутайтесь в разверностях!

Пока - удачи! Если будут еще вопросы - я и на третий раз расскажу. Ну все, пора и мне на работу 

Да, и еще немного - "чисто для общего развития" - посмотрите вот здесь

http://www.xumuk.ru/toxicchem/59.html

- это чтобы "не изобретать велосипед" лишний раз. Да и чтобы можно было "украсить" список литературы. Кстати, тот же самый метод Васильевой, самый распространенный сейчас в практике химико-токсикологических исследований, первоначально создавался (начало 40-х годов, война...) именно для выделения алкалоидов из растительного сырья (мука, зерновые...).

И еще - чтобы потом не ссылаться, что "тут один дяденька на форуме сказал...", поищите Кларка в Сети (он где-то обязательно должен быть), посмотрите картинки в частной статье на никотин. Заодно и еще одна литературная ссылка будет. Если уж совсем не найдете сами - постараюсь помочь...

[Sona_seg]

Доброго времени суток, chemist-sib.  и снова большущее спасибо!

После Вашего легкого и позитивного стеба, чувствую себя еще большим чайником, чем в «начале разговора»… но это, в общем то, недалеко от истины    и поэтому «продолжаем разговор»  

 

уточняю. важна именно вытяжка. дело в том, что проведено токсикологическое исследование (в рамках НИР и, таки да, результаты - в диссер) - экспериментальное моделирование начальных этапов формирования никотинозависимости. именно поэтому использовалась водная вытяжка, в самом упрощенном варианте - табачный "чай". а поскольку формирование никотинозависимости сопровождается развитием толерантности, крепость этого "чая" периодически увеличивалась. т.е. единственно возможный растворитель (экстрагирующее вещество) в данном случае – вода, поскольку поить крыс подщелоченным или подкисленным водным раствором (а в идеале для СФМ-исследования фактически 0,1 н. кислотой) было бы уже совсем жестоко, равно как и бессмысленно (даже использование слабокислых растворов органических кислот могло внести свои коррективы в токсикологическую картину, а чтобы вычленить эти коррективы пришлось бы использовать дополнительных животных, что совершенно неоправданно, даже с учетом благих целей). исходя из этого, максимально возможное извлечение никотина из табачного сырья в задачах не значится. работаем с вытяжками «как есть». а вот по поводу сравнительных экспериментов, мне и самой было интересно. есть несколько вариантов приготовления таких вытяжек (температура, длительность экстракции и др.), поэтому я планировала сравнить концентрации никотина в разных вытяжках (при одинаковых соотношениях исходных ингредиентов). но это ветка…

дальше… да-да, с кислотой в 2-3 мл я, конечно, дала маху   но чувствую, что дам еще большего, задав очередной глупый вопрос: если при подкислении раствора ориентироваться на рН 0,1 н. солянки (если я правильно поняла, именно соляной, а не серной, о которой говорилось раньше), то нельзя ли использовать вытяжку для «разбавления» более концентрированной НСl, как если бы мы готовили 0,1 н. раствор НСl с водой? Хотя это, конечно, не гарантирует нам нужную кислотность раствора, учитывая начальную (собственную) кислотность вытяжки… тогда можно ориентироваться на рН 0,1 н. НСl  (1,0) и довести вытяжку до нужной рН более концентрированным раствором кислоты? хотя, наверное, надежнее все-таки ступенчатое разбавление.

фраза «…можно почистить вытяжку из того же табака на пластинке и снять с нее пятно чистого никотина, и снять его спектры» меня воодушевила, но скажу честно, не представляю как это сделать. пока самым «подходящим» методом «очистки» никотина была отгонка его из вытяжки с водяными парами. но это не гарантирует чистый никотиновый раствор, хотя работать с ним будет проще (меньше  соэкстрактивных веществ => меньше погрешность => есть шанс получить что-то похожее на «официальные версии» графиков для никотина). Кларка нашла, правда, еще не нашла в нем нужных картинок (не дошли руки), обязательно посмотрю публикации (постараюсь озадачиться этим в ближайшее время) по спекрофотометрии вообще и никотину в частности. Здесь мне, похоже, придется поднимать целину  так что спасибо за ссылки.

Удачи и Вам!

[chemist-sib]

Теперь с объектом - все понятно: неважно, что там с первоначальной "травкой", важно - что в готовом чайке, чае и чифире... Одна "головная боль" по поводу полноты изолирования - для целей аналитики - ушла. За отсутствие ацидоза и некрозов ЖКТ у крысок я теперь тоже спокоен; никотинозависимость - это им гораздо приятнее будет... С уровнем работы - тоже прояснилось; это я к тому, что и как надо делать и показывать, что именно так - можно... Про то, как сделать чистый никотин безо всякой перегонки и получения второго высшего - обязательно расскажу "на пальцах" (не используя при этом средний). Но все это - чуть-чуть попозже, ладно?.. А то - ясная и теплая погода у нас завтра заканчивается, а я еще план по весеннему загару недовыполнил... Может, тем временем, более сУрьезные аналитики на anchem.ru.forum Вам еще что-то стоящее посоветуют. Прощаюсь, но не надолго. Удачи! 

[Sona_seg]

ну вот, с третьей попытки, наконец объяснила толком, что мне нужно  . 

буду очень рада продолжению разговора... попозже. за это время постараюсь "войти в тему" и разделить "коней и людей" в своей голове   . 

а Вам отличных выходных и солнышка несмотря ни на что, ни на какие прогнозы .

удачи!  

[chemist-sib]

«…И Шахрезада продолжила дозволенные речи…». Доброго времени суток, Sona_Seg! Похоже, именно «вашими молитвами» мне урвалось вчера немножко света и тепла, прежде чем началось очередное похолодание. Отдышался, отоспался, откормился – теперь можно и за «родную отраву» поговорить.

А чтобы не походить на «безответственного теоретика», я вчера на работе выкроил немножко времени, стрельнул сигаретку у курящей коллеги, «заварил чайку» из нее и, профильтровав его и хорошо разбавив его 0,1 н солянкой (ес-но, «на глазок», где-то раз в 50), снял на своем стареньком СФ-46 спектр кислой формы. Потом, подщелочив растворы в кюветах добавлением в каждую по паре капель 30% раствора едкого натра, снял еще и щелочной спектр. И уже из своих «старых загашников» вытащил спектры никотина, выделенного ex tempore из табака, но почищенного на пластинке. Экселевскую табличку прикладываю. Коль скоро вы смогли найти Кларка, то в нем, в 4-ом издании, специальная статья на никотин (Nicotine) находится на p.1772-1776, в ней же – и спектры. Поэтому – смотрите, сравнивайте.

Что сам пока могу сказать: никотин в водной вытяжке – есть, на прямом спектре и безо всяких дополнительных очисток он виден, но, если уж совсем строго подходить, спектр его слегка засран искажен чем-то еще (могу абсолютно безответственно ляпнуть, что это – полифенольные соединения, всегда присутствующие в растительном сырье и обуславливающие желто-коричневый цвет водной вытяжки. Похоже, именно они дали слабую размытую полосу поглощения в кислом растворе в районе 290 нм, исчезнувшую после подщелачивания). Это я прикидываю по соотношению плотностей в максимумах и минимумах, просто - по виду картинок. Как это строго описать - пока не скажу, бо - не знаю. Т.е., если совсем строго возвращаться к нашему никотину, его концентрацию нужно бы считать по исправленной оптической плотности (измеренная минус фон), но т.к., с помощьььью «простых телодвижений» этот фон определить достаточно проблематично – то «грех не велик»! Назовем этот метод скромно – «…в первом приближении…». Т.е., использовать его для целей стандартизации «химико-наркологической атаки» на крысок вполне возможно (ИМХО такое!).

Согласен с моими коллегами с anchem.ru, что проще всего вам было «подружиться» с местными судебниками - это, действительно, "их грядка". К сожалению, единственный мой белорусский хороший «контакт» с таким коллегой находится не в Минске, а в Бресте, к тому же он сейчас заслуженно отдыхает, а по возвращении из отпуска вновь будет завален работой «по самое нехочу…». Поэтому оставим такой вариант на самый крайний случай, угу? Попробуем пока разобраться сами.

Расчет концентрации никотина в исходном «чае» будет выглядеть такой формулой: С (мкг/мл) = D x 10⁴ x V₂ / (E x V₁), где D и E – понятно, что; V₁ – объем аликвоты «чая», взятой для разбавления, а V₂ – объем, до которого вы эту самую аликвоту разбавили 0,1 н солянкой (объемы, ес-но, берутся в одинаковых единицах измерения). Ну, а 10⁴ – это просто коэффициент пересчета из «не особо системных» г/100 мл (что предполагает определение удельного коэффициента поглощения) во вполне цивильные мкг/мл.

Теперь, что касается кислоты. Да, вполне возможно воспользоваться 0,1 н серной кислотой – такая же, оптически неактивная среда. Вся то разница будет в том, что любые капельки сернокислотных растворов, попавшие куда угодно, со временем с почти 100% вероятностью превращаются в дырочки («смерть колготкам!»), а растворы солянки – в этом плане почти безобидны. Но, на всякий случай, даже если пойдете на такую замену – лучше бы в отчетах писать «как надо» - меньше будет возможностей «колупаться в глазу»…

Да, если вдруг ваш Excel не откроет эту табличку – «свистните», перезалью для другой версии. И, еще – если вдруг захотите продолжить разговор в личке – милости прошу!

Удачи! 

ЗЫ: форумный движок-зараза! Не хочет прикреплять к ответу табличку Excel! Попробую просто картинки в виде тестового файла... 

ЗЫЗЫ: опять - не то!.. Перехожу в личку...

Изменено 7 Мая, 2016 в 07:40 пользователем chemist-sib

[aversun]

ЗЫ: форумный движок-зараза! Не хочет прикреплять к ответу табличку Excel! Попробую просто картинки в виде тестового файла... 

ЗЫЗЫ: опять - не то!.. Перехожу в личку...

 

Это делается так

Excel.xls.pdf

Удаляете последние 4 символа, что бы получилось Excel.xls, все. 

Изменено 7 Мая, 2016 в 22:04 пользователем aversun

[chemist-sib]

Спасибо, коллега aversun, теперь буду знать! И - с наступающим Праздником!

Изменено 8 Мая, 2016 в 01:03 пользователем chemist-sib