Улучшение Т-лимфоцитов

[Alvaro]

CRISPR успешно редактирует Т-лимфоциты человека

 

 

В ходе проекта, инициированного исследователями из Калифорнийского Университета Сан-Франциско (University of California, San Francisco, США), ученые изобрели новую стратегию точной модификации Т-лимфоцитов человека с использованием системы редактирования генома, известную как CRISPR/Cas9. В связи с тем, что клетки иммунной системы играют важную роль в ряде заболеваний, от диабета до СПИДа и рака, достижение представляет собой новый разносторонний метод исследования функций Т-клеток, а также способ терапии многий серьезных заболеваний.

Используя новаторский подход, исследователям удалось деактивировать белок CXCR4 на поверхности Т-клеток, который может использоваться ВИЧ при их инфицировании и развитии СПИДа. Группа ученых также успешно выключила белок PD-1, привлекающий внимание в быстро развивающейся области противораковой иммунотерапии, поскольку исследователи продемонстрировали, что использование препаратов, блокирующих PD-1, вызывает атаку опухоли Т-лимфоцитами.

Система CRISPR/Cas9 вызывает интерес не только ученых, но и общественности, поскольку делает возможным легкое и недорогое редактирование генетической информации, теоретически, в любом организме. Т-клетки, циркулирующие в крови, являются очевидными кандидатами для медицинского применения технологии, поскольку они не только находятся в центре многих патогенных процессов, но их можно легко получить у пациентов, подвергнуть редактированию, и затем возвратить в организм для развития терапевтического действия.

Однако практически редактирование геномов Т-лимфоцитов с помощью CRISPR/Cas9 оказалось удивительно сложным, утверждает доктор философии Александр Марсон (Alexander Marson), главный автор публикации. «Редактирование генома Т-клеток человека стало существенной проблемой. Мы потратили последние полтора года, пытаясь оптимизировать редактирование в функциональных Т-клетках. Существует множество потенциальных терапевтических областей применения метода, и мы хотим быть уверенными, что развиваем его настолько, насколько можем», – говорит ученый.

Настоящая работа была выполнена при содействии Инновационной Геномной Инициативы (Innovative Genomics Initiative, IGI) - совместной программы UCSF и Калифорнийского Университета Беркли (University of California, Berkley, США), возглавляемой доктором философии Дженнифер Дудна (Jennifer Doudna) и доктором философии, профессором клеточной и молекулярной фармакологии UCSF Джонатаном Вайссманом (Jonathan Weissman).

Cas9 – фермент системы CRISPR, делающий разрезы в последовательности ДНК и позволяющий вставить в нее новую генетическую информацию, – внедряется в клетки с использованием вирусов или кольцевых фрагментов ДНК, называемых плазмидами. На следующем этапе в клетку вводится генетическая конструкция, известная как РНК-гид, направляющая фермент в определенные участки ДНК, где необходимы надрезы.

Однако до недавнего времени метод редактирования Т-лимфоцитов человека с помощью системы CRISPR/Cas9 был неэффективен, поскольку успешной модификации подвергалась относительно небольшая доля клеток. Несмотря на то, что ученым удалось достичь успеха в выключении генов путем вставки или удаления случайных последовательностей, у них все еще не получалось использовать CRISPR/Cas9 для вставки (или «включения») специфических новых последовательностей для коррекции мутаций Т-клеток.

Как сообщается в он-лайн публикации журнала Proceedings of the National Academy of Sciences, группа исследователей, возглавляемая первым автором статьи доктором философии Катрин Шуманн (Kathrin Schumann), являющейся сотрудником лаборатории Марсона, и доктором философии Стивеном Лин (Steven Lin) из лаборатории Доудна, решила эти проблемы, усилив доставку Cas9 и РНК-гида в клетки.

В лабораторных условиях группа собрала Cas9-рибонуклеопротеины, или РНП, сочетающие белок Cas9 с РНК-гидом. Затем они использовали метод электропорации, при котором клетки экспонируются в электрическом поле, повышающем проницаемость их мембран, для быстрой доставки РНП внутрь.

Благодаря такой инновации исследователи смогли успешно редактировать CXCR4 и PD-1, вставив новые последовательности вместо определенных «букв» в гены этих белков. Затем исследовательская группа отсортировала клетки, используя маркеры клеточной поверхности, чтобы выделить успешно отредактированные клетки для дальнейшего исследования и, возможно, терапевтического использования.

Марсон подчеркивает, что, в отличие от редактирования эмбрионов человека посредством метода CRISPR/Cas9, сообщение о котором вызвало споры, Т-клетки создаются заново в каждом человеке, поэтому их модификации не будут переданы следующим поколениям. Ученый надеется, что Cas9-терапия заболеваний, связанных с Т-лимфоцитами, к которым относятся различные аутоиммунные нарушения и, в том числе, тяжелый комбинированный иммунодефицит, в будущем будет внедрена в клинику.

«Дорожка внедрения модифицированных Т-клеток в организм пациента уже хорошо проторена. Существуют компании, которые занимаются этим методом и работают над безопасностью терапии, и существует разрастающаяся клиническая инфраструктура, которую мы могли бы дополнить по мере разработки более точных деталей геномного редактирования, – рассказывает Марсон, – Я думаю, что редактированные Т-клетки будут напрямую вводиться пациентам, и было бы ошибкой не думать о шагах, которые необходимо предпринять для эффективности и безопасности».

 

[Тот Самый 1]

Тот благословляет.

В России создали лекарство от рака и проверили его в космосе

[invidia]

Японцы улучшили Т-лимфоциты используя стволовые клетки.   

 

Японцы методом генной инженерии создали Т-лимфоциты, уничтожающие рак

Сотрудники исследовательского центра аллергии и иммунологии при японском Институте физико-химических исследований объявили о создании цитотоксических Т-лимфоцитов, уничтожающих раковые опухоли, из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS).

Сотрудники исследовательского центра аллергии и иммунологии при японском Институте физико-химических исследований объявили о создании цитотоксических Т-лимфоцитов, уничтожающих раковые опухоли, из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS). Для этого ученые перепрограммировали в iPS Т-лимфоциты, специализирующиеся на уничтожении определенного вида рака. В будущем лимфоциты, регенерированные из iPS, потенциально смогут служить основой противораковой терапии, полагают ученые.

Предыдущие исследования показали, что цитотоксические Т-лимфоциты, полученные в лабораторных условиях, неэффективны в деле уничтожения раковых клеток из-за краткой продолжительности своей жизни. Японские исследователи преодолели этот недостаток, и на следующем этапе собираются проверить, способны ли созданные ими Т-клетки избирательно уничтожать клетки опухоли, не затрагивая другие. Если да, то такие Т-лимфоциты, регенерированные из iPS, можно будет непосредственно вводить пациентам путем инъекции для лечения, причем это было бы осуществимо уже не в очень отдаленном будущем, полагают ученые.

 

[Alvaro]

Японцы улучшили Т-лимфоциты используя стволовые клетки.   

Очень короткий текст!

 

Есть немного больше:

 

 

Из стволовых клеток можно вырастить Т-лимфоциты, убивающие рак

 

 

 

Из стволовых клеток можно вырастить Т-лимфоциты, убивающие рак

 

Исследователи из Японии доказали возможность получить из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSC) специфичные иммунные клетки, которые побеждают рак.

 

Их работа приблизила тот день, когда в клинической практике будут использоваться клонированные клетки самих пациентов, усиливающие способность иммунной системы сопротивляться раку.

 

Исследователи из Центра изучения аллергии и иммунологии RIKEN (Иокогама) описали, как им удалось создать специфические Т-лимфоциты против рака из собственных плюрипотентных стволовых клеток. Это уникальное исследование было опубликовано онлайн на веб-странице «Cell Stem Cell».

 

Хироши Кавамото и его коллеги начали со зрелых Т-лимфоцитов, специфичных к определенному типу рака, и перепрограммировали их в IPSC с помощью факторов Яманаки. Эти IPSC в дальнейшем генерировали полностью функциональные и активные Т-клетки. Факторы Яманаки были названы в честь японца Ш. Яманаки, который вместе с британским ученым Дж. Гердоном получил Нобелевскую премию по медицине и физиологии в 2012 году за открытие способности зрелых клеток превращаться в плюрипотентные стволовые клетки.

 

Яманака обнаружил, что воздействие на клетки кожи четырьмя фрагментами ДНК (факторами Яманаки) возвращает их в их плюрипотентное состояние. В этом виде клетки способны, подобно эмбриональным стволовым клеткам, превращаться практически в любые клетки организма.

 

Говоря о своем прорыве в развитии специфичных Т-клеток против рака, доктор Кавамото заявил: «Мы преуспели в развитии антиген-специфичных Т-клеток путем преобразования их в IPSC с последующей дифференциацией до новых Т-лимфоцитов».

 

Предпринятые ранее попытки использовать традиционные методы для создания специфичных Т-лимфоцитов были не очень успешными. Клетки не могли бороться с раком, что было обусловлено очень короткой продолжительностью их жизни в теле пациента. Доктор Кавамото и его коллеги решили, что успех принесет именно путь IPSC-клеток. После создания специфичного к меланоме Т-лимфоцита они превратили его в IPSC, а затем вырастили зрелые и полноценные Т-киллеры.

 

Исследователи доказали, что новое поколение Т-киллеров специфично к тому же самому типу меланомы, что и их предшественник. Новые клетки сохранили генетическую структуру, которая дает возможность реагировать на особые протеины клеток меланомы. По словам доктора Кавамото, 90% новых лимфоцитов отреагировало на клетки рака, против которых их создавали. Наблюдение показало, что новые Т-лимфоциты оставались активными и жизнеспособными, а также могли продуцировать противоопухолевое вещество гамма-интерферон при контакте с антигенами рака.

 

Теперь Кавамото и его коллеги планируют протестировать способность Т-киллеров убивать раковые клетки без урона клеткам хозяина, то есть не вызывая аутоиммунный процесс.

 

«Если это так, то эти клетки можно просто выращивать в лаборатории для конкретного пациента и вводить ему в кровь для лечения рака. Технологию можно будет реализовать уже в недалеком будущем», - заявил доктор Кавамото.

 

 

 

 

 

Стволовые клетки помогут иммунной системе побороть инфекционные и онкологические заболевания

 

 

Клетки иммунной системы человека способны идентифицировать и уничтожать патогены и раковые клетки, однако, зачастую они недостаточно многочисленны, и время их жизни слишком коротко для атаки достаточно агрессивных опухолей или вторжения инфекционных агентов. В двух независимых статьях в журнале Cell Stem Cell исследователи сообщают о возможности регенерации клеток иммунной системы человека благодаря технологии стволовых клеток. Ученым удалось получить большое количество долгоживущих клеток, способных распознавать специфические мишени – ВИЧ-инфицированные клетки в одном случае и опухолевые клетки в другом.

 

Полученные результаты могли бы помочь в разработке стратегии восстановления истощенного иммунного ответа пациента.

 

Разработанные исследовательскими группами методики подразумевают использование уже известных факторов для обращения зрелых иммунных Т-клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК), которые теоретически могут дифференцироваться в любой тип клеток организма. Получив иПСК, ученые «направили» их на повторную дифференцировку в Т-клетки. Важно отметить, что новые Т-клетки были «омоложены» и обладали повышенными потенциалом роста и продолжительностью жизни, сохраняя при этом их исходную способность уничтожать опухолевые и ВИЧ-инфицированные клетки. Полученные сведения позволяют предположить, что использование Т-клеток с применением технологии иПСК может в будущем стать основой эффективной иммунной терапии.

 

В одной из работ исследователи использовали Т-клетки, полученные от ВИЧ-инфицированного пациента. Созданные с применением технологии иПСК повторно дифференцированные клетки имели неограниченную продолжительностью жизни и длинные теломеры. Это имеет особое значение, поскольку в норме старение Т-клеток ограничивает их размножение, делая их неэффективными для использования в терапии.

 

«Разработанная нами методика позволяет получать «молодые и активные» Т-клетки для адаптивной иммунотерапии против вирусной инфекции или рака», - рассказывает главный автор публикации доктор Хиромитсу Накаучи (Hiromitsu Nakauchi) из Университета Токио (University of Tokyo, Япония).

 

Другая группа ученых исследовала Т-клетки, полученные от пациента со злокачественной меланомой. Созданные ими редифференцированные клетки распознавали белок MART-1, который обычно экспрессируется в меланомных опухолях.

 

«Следующий шаг, который мы собираемся сделать – проверить, могут ли «новые» Т-клетки избирательно уничтожать именно опухолевые клетки, а не клетки других здоровых тканей. Если бы такие клетки действительно формировались, они могли бы напрямую применяться для лечения пациентов, - говорит главный автор публикации доктор Хироши Кавамото (Hiroshi Kawamoto) из Исследовательского Центра Аллергии и Иммунологии RIKEN (RIKEN Research Center for Allergy and Immunology), - Думаю, это можно будет осуществить в недалеком будущем».

 

 

 

 

 

Гибридные иммунные клетки побеждают рак

 

 

 

 

Гибридные иммунные клетки побеждают рак

 

В начале 2013 г. опубликованы первые отчеты об успешных клинических испытаниях способа лечения рака путем введения пациенту его собственных перепрограммированных клеток иммунитета: цитотоксичных Т-лимфоцитов, число которых в организме многократно увеличивается. Т-лимфоциты выборочно убивают раковые клетки, на которые они нацелены. Тем временем Новартис, крупнейшая фармацевтическая компания, уже заключила эксклюзивное лицензионное соглашение с американским университетом, где разрабатывается методика, и приобрела исключительные права на применение этого способа лечения.

 

В обычном состоянии раковые клетки неопознаваемы для иммунной системы человека. Тем не менее в последние несколько лет ученые в Японии и США добились успехов в лечении раковых заболеваний путем перепрограммирования иммунитета пациента против клеток злокачественных новообразований. В начале 2000-х ученые медики в лабораторной культуре клеток и на модели лабораторных животных опробовали гибриды дендритных клеток с раковыми клетками для стимулирования выработки антираковых цитотоксичных Т-лимфоцитов, иными словами, клеток-убийц нацеленных на раковые клетки. Дендритные клетки выполняют в организме человека своеобразную роль обучения клеток иммунитета опознавать чужеродные белки и содержащие их клетки, представляющие опасность для организма. Оказалось, что если искусственно создать гибридные клетки путем слияния дендритных клеток с раковыми клетками (DC-tumor hybrids), то такие химерные клетки будут обучать Т-лимфоциты распознавать и убивать раковые клетки.

 

В январе 2013 г. группа японских ученых под руководством Хироши Кавамото (Hiroshi Kawamoto) в Исследовательском Центре по Аллергии и Иммунологии в Йокогами, Япония успешно перепрограммировала Т-лимфоциты в стволовые клетки, так называемые плюрипонентные стволовые клетки (iPS), которые быстро размножались и при созревании превращались в цитотоксичные Т-лимфоциты, способные находить в организме по целевому белку-антигену и убивать раковые клетки. Для исследователей оставалось неясным будут ли вновь созданные Т-клетки безвредны при введении в организм человека.

 

В марте 2013 г. появилось сообщение, что в США у двоих детей с агрессивной формой детской лейкемии наступило полное выздоровление от их болезни – никаких свидетельств раковых клеток в их организмах – после лечения с помощью новейшей клеточной терапии, которая перепрограммирует их иммунные клетки в быстро растущие и уничтожает клетки лейкемии. Эти первые и успешные клинические испытания провела научная группа из Детского госпиталя Филадельфии и Университета Пенсильвании. Их статья по данной теме была опубликована 18 апреля 2013 г. в Журнале Медицины Новой Англии (The New England Journal of Medicine). Название статьи звучит как «Лечение лейкемии с помощью измененных Т-клеток путем присоединения к ним химерных антигенных рецепторов».

 

Одна из пациентов, 7-летняя Эмили Уайтхед, стала известной в новостях в декабре 2012 г. после экспериментального лечения, приведшего к ее удивительному выздоровлению после того, как у нее возник рецидив болезни после обычного лечения. Эмили остается здоровой в течение 11 месяцев после получения биоинженерных Т-клеток, которые были нацелены на мишень, найденную в этом типе лейкемии, называемой острая лимфобластная лейкемия (ALL).

 

У другой пациентки, 10-летней девочки, у которой также оказалось безуспешным обычное лечение, возник рецидив через два месяца после лечения Т-лимфоцитами, когда появились другие клетки лейкемии, которые не несли специфического клеточного рецептора, на который было направлено лечение. Медики повторили лечение новым поколением Т-клеток, нацеленных на другие мишени на поверхности раковых клеток, и добились выздоровления.

 

Первый соавтор статьи Доктор медицины Стефан А. Грапп (Stephan A. Grupp) является директором Лаборатории Трансляционного Изучения в Центре изучения рака у детей при Детском госпитале Филадельфии, и профессором педиатрии в Школе медицины Перельмана при Университете Пенсильвании.

 

Настоящее исследование основано на сотрудничестве Граппа с учеными-медиками Университета Пенсильвании, которые первыми разработали модификацию Т-клеток для лечения лейкемий, вызываемых В-клетками (B-cell). Группа ученых Университета Пенсильвании сообщала о начальных результатах испытаний с использованием терапии этими клетками у трех взрослых пациентов с хронической лимфоцитозной лейкемией (CLL) в 2011 г. Двое из этих пациентов остаются в ремиссии уже более 2-х с половиной лет после лечения, и, как докладывали исследователи Университета Пенсильвании в декабре 2012 г., у семи из десяти взрослых пациентов, получавших такое лечение, отмечен положительный результат. Эту группу возглавлял доктор Карл Джун (Carl H. June, M.D.), профессор иммунотерапии факультета Патологии и лабораторной медицины в Школе медицины при Университете Пенсильвании и директор Лаборатории Трансляционного Исследования в Раковом Центре Абрамсона в Пенсильвании.

 

«Мы надеемся, что наши усилия по лечению пациентов путем персонализированной клеточной терапии уменьшат или даже заменят потребность в трансплантациях костного мозга, которые сопряжены с риском высокой смертности и требуют долгосрочной госпитализации» – сказал Д-р Джун. «В долгосрочной перспективе, если лечение будет эффективным у этих больных в поздней стадии, мы бы хотели изучить его применение для лечения на ранних стадиях и, возможно, придем к ситуации, где лечение лейкоза можно будет рассматривать без химиотерапии.»

 

Команда исследователей, возглавляемая Д-ром Граппом, адаптировала оригинальный способ лечения CLL для борьбы с другой формой B-клеточного лейкоза – ALL, которая является наиболее распространенной формой рака у детей. После десятилетий исследований онкологи в настоящее время могут вылечить 85% детей с ALL. Оба ребенка имели рак ALL высокого риска, который упорно не поддавался лечению традиционными методами.

 

Новое исследование использует сравнительно новый подход в лечении рака: иммунотерапия, которая манипулирует иммунной системой для повышения ее способности бороться с раком. Здесь исследователи изменили Т-клетки путем клеточной инженерии, чтобы они выборочно убивали иммунные клетки другого типа под названием B-клетки, ставшие раковыми.

 

Исследователи забирали несколько собственных T-клеток у каждого пациента и изменяли их в лаборатории для появления у них химерного антигенного рецептора CAR (chimeric antigen receptor) типа, которые называются CTL019 клетки. Эти клетки предназначены для нападения на белок, называемый CD19, который появляется на поверхности только B-клеток.

 

Создавая антитело, которое распознает CD19 и присоединив что антитело к Т-клеткам, исследователи получили CTL019 клетки, которые стали своего рода ракетой, которая находит и убивает В-клетки, и тем самым атакует B-клеточный лейкоз. После возвращения в тело пациента, CTL019 клетки размножаются, их количество увеличивается в тысячу раз и они циркулируют по всему телу. Важно отметить, что они сохраняются в течение нескольких месяцев, не допуская повторного возникновения этого типа лейкемии.

 

CTL019 терапия устраняет все В-клетки, которые несут клеточный рецептор CD19: как здоровые клетки, так и клетки с лейкемией. Пациенты могут жить без B-клеток, хотя им необходима регулярная замещающая инфузия иммуноглобулина, которая может проводиться дома, для того, чтобы осуществлялась выполняемая В-клетками роль в иммунитете. В дальнейшем в организме появляются новые нормальные В-клетки.

 

Исследовательская группа продолжает совершенствовать свой метод с помощью этой новой технологии и исследовать причины, почему некоторые пациенты могут не реагировать на терапию или могут испытывать рецидивы болезни. Д-р Грапп считает, что появление CD19-отрицательных лейкозных клеток у второй из пациенток может быть результатом ее предыдущего лечения. Онкологи ранее лечили ее лекарством Блинатумомаб (Blinatumomab), которое представляет собой моноклональные антитела, в надежде излечить рак. Предыдущее лечение могло выборочно способствовать появлению популяции CD19-отрицательных Т-клеток.

 

«Возникновение опухолевых клеток, которые больше не содержат целевого белка предполагает, что у некоторых больных с ALL высокого риска нам придется расширить лечение, подключив дополнительные Т-клетки, которые будут направлены на дополнительные цели» – считает Д-р Грапп. «Однако, первоначальные результаты в данном направлении иммунотерапии являются обнадеживающими и в последующем может быть разработано лечение других типов рака».

 

Это исследование было финансировано Национальными институтами здравоохранения США, Обществом лейкемии и лимфомы и Альянсом генной терапии рака.

 

В августе 2012 года Университет Пенсильвании и крупнейшая фармацевтическая фирма Новартис объявили об эксклюзивном глобальном исследовании и лицензионном соглашении для дальнейшего изучения и коммерциализации этой новой клеточной иммунотерапии с использованием технологий химерных антигенных рецепторов (chimeric antigen receptor, CAR). В рамках этой транзакции, фирма Новартис приобрела исключительные права от Университета Пенсильвании на терапевтический проект CART-19, который был предметом описанных выше клинических испытаний и который сейчас известен как CTL019.

 

 

 

 

В двух независимых статьях в журнале Cell Stem Cell исследователи сообщают о возможности регенерации клеток иммунной системы человека благодаря технологии стволовых клеток.

Главный автор публикаций доктор Хиромитсу Накаучи (Hiromitsu Nakauchi)

cell stem cell hiroshi kawamoto

оригинал

 

 

 

 

Особенности

иПСК, полученные из Т-клеток, специфичных для меланома эпитоп MART-1

Дифференциация ИПСК в Т-клеток с MART-1 специфическим рецептором Т-клеток

MART-1 на основе стимуляции Т-клеток демонстрирует сохранил антигенную специфичность

 

Резюме

Антиген-специфические Т - клетки представляют собой потенциальный терапевтический путь для множества условий, но в настоящее время подходы к генерации таких клеток в терапевтических целях, ограничены. В данном исследовании мы установили ИПСК из зрелых цитотоксических Т - клеток , специфичных для меланомы эпитопа MART-1. Когда культивируют совместно с OP9 / клетками Dll1, эти иПСК эффективно собирать TCR & beta ; + CD4 + CD8 + двойной положительный (DP) клетки , экспрессирующие Т - клеточный рецептор (TCR) , специфичного к MART-1 эпитоп. Стимуляция этих клеток DP с анти-CD3 антителом генерируется большое количество CD8 + Т - клеток, и более 90% из всего количества клеток были специфичными для оригинального MART-1 эпитоп. Стимуляция CD8 + Т - клеток с MART 1-антиген-представляющих клеток приводит к секреции IFN & gamma ; , демонстрируя свою специфическую реактивность. Таким образом, настоящее исследование иллюстрирует подход для клонирования и расширения функциональных антиген-специфических CD8 + Т - клеток , которые могут быть применимы в клеточной терапии рака.

 

Основной текст

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут быть получены из различных типов соматических клеток путем перепрограммирования с помощью факторов Яманака (Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус) ( Такахаши и Яманака, 2006 ; Takahashi и др . , 2007 ; Grskovic др и др., 2011 ). иПСК , как сообщается, очень похожи на эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) во многих отношениях, в том числе экспрессии генов и плюрипотентных характеристик. Поскольку иПСК не подчиняются тем же этическим проблемам , как ЭСК, они имеют большой потенциал в качестве основного источника клеток для производства различных типов клеток или органов в регенеративной медицине.

 

Одним из возможных применений ИПСК является использование их в качестве источника клеток для получения лимфоцитов для клеточной терапии против рака. Иммунотерапия подходы для лечения рака уже широко применяется в клинических условиях. Большинство подходов , используемых целью активировать опухольспецифические цитотоксических Т - лимфоцитов (ЦТЛ), которые фенотипически характеризуются как CD3 + CD4 - CD8 + (CD8 одного положительного: CD8SP) клеток ( Sensi и Anichini, 2006 ). Несмотря на то, что в результате активированные CTL , демонстрируют некоторую эффективность в уничтожения опухолевых клеток, в большинстве случаев этот эффект не является достаточно существенным , чтобы вылечить пациента. Основным ограничивающим фактором такого подхода является недолговечность активированных ЦТЛ, которые инактивируют довольно быстро антиген-индуцированной гибели клеток ( Mescher и др . , 2007 ; Willimsky и Бланкенштайн, 2005 ).

 

Нам казалось , что применение технологии иПСК для клонирования и расширения опухоли антиген-специфические Т - клетки потенциально могут решить эту проблему. Предыдущие исследования сообщили об успешном перепрограммирования зрелых Т - клеток и В - клеток с помощью переноса ядра, что приводит к получению клонированных мышей , которые обеспечили формальное доказательство того, что ядро зрелой соматической клетки может быть полностью перепрограммирован ( Hochedlinger и Йениш, 2002 ; Ватарай и др ., 2010b ). До сих пор, перепрограммирования зрелых лимфоцитов в ИПСК было успешно выполнено для мышиных В - клеток ( Ханна и др . , 2008 ; . Вада и др 2011 ), для мышиных Т - клеток ( . Ватарай и др, 2010а ), так и для человека T клетки ( . Loh и др 2010 ; Секи и др . , 2010 ). Одновременно с этим , мы разработали методы для дифференциации лимфоцитов из ИПСК , которые были получены из лимфоцитов. У мышей, мы уже продемонстрировали успех с этим подходом с использованием зрелых NKT клеток ( Ватарай и др., 2010a ).

 

Предыдущие исследования , которые преуспели в производстве ИПСК из Т - клеток человека , используемых цельной периферической мононуклеаров или CD3 + клеток в качестве источника ( Loh и др . , 2010 ; Секи и др . , 2010 ). Таким образом, остается показать , что изолированные CTL , можно перепрограммировать , чтобы сформировать ИПСК. Поэтому вначале мы исследовали перепрограммирование CD8 + Т - клеток , выделенных из крови человека мозга и периферической крови взрослого с помощью клеточного сортировщика ( рис S1 доступного в режиме реального времени ). Целые CD3 + клеток, а также не-Т - клеток, то есть, родословная маркер отрицательной (Lin - ) CD34 + гемопоэтические клетки - предшественники ( рис S1 B), также были использованы в качестве источников клеток. Выделенные Т - клетки также активируются путем приема стимуляции с анти-CD3 и анти-CD28 моноклональных антител. На 1 -й день клетки инфицировали вирусом Сендай ( Fusaki и др., 2009 ) , несущий четыре Яманака фактора (Klf4, Sox2, Oct4, и с-Мус) и SV40 (большой Т - антиген) ( Park и др., 2008 ) , Полученные колонии были собраны между 21 -й день и 35 -й день для расширения ( рис S1 C). В конечном счете колонии , полученные из Т - клеток , показали , что морфология почти идентична типичной человеческой ESC (чЭСК) колоний ( рис S1 D). В иПСК выражены характерные маркеры , такие как ESC SSEA4, TRA-1-60 и TRA-1-81. Мы обозначили ИПСК , полученные из CD34 + клетки пуповинной крови, целые CD3 + Т - клеток, и CD8 + Т - клеток , как HCB-ИПСК, ХТ-ИПСК и hCD8-ИПСК, соответственно.

 

Для того, чтобы подтвердить , что ХТ-иПСК и hCD8-иПСК получены из Т - клеток, мы проанализировали перегруппировки статус гена цепи TCR & beta ; путем определения последовательности TCRVβ области. Во всех случаях, перестраиваются конструкции были обнаружены ( рис S1 Е), что указывает , что клетки были получены из Т - клеток. Мы также исследовали ли hCD8-иПСК способны вырабатывать клетки Т - клональные путем сокультивировани их с OP9 , а затем OP9 / Dll1 стромальных клеток ( рис S2 A) ( Тиммермансом и др . , 2009 ; Vodyanik и Slukvin, 2007 ), с по сравнению с ЭСК и HCB-иПСК в качестве контроля. Примерно на день 40, CD4 + CD8 + двойной положительный (DP) клетки были получены во всех трех группах ( рис S2 B). Несмотря на то, проточной цитометрии профили CD4 против экспрессии CD8 были почти неотличимы среди трех групп, доля TCR & beta ; + CD3 + клеток в клетках DP от hCD8-ИПСК была значительно выше , чем в других группах ( рис S2 C). Эти результаты указывают на то, что иПСК подшипник переставить гены TCR способны эффективно вызывать ТКС-экспрессирующих клеток на стадии предварительного отбора.

 

Затем мы применили эти результаты для генерации ИПСК из антиген-специфических Т - клеток. Потому что наша общая цель заключается в регенерации Т - клеток , которые могут быть использованы для клеточной терапии против рака, в качестве источника клеток мы выбрали ЦТЛ , специфичных к меланоме эпитоп MART-1. JKF6 клетки являются долгосрочными культивированные опухолевые проникали лимфоциты , которые были первоначально получены от пациента с меланомой и поддерживались в хирургии отделения Национального института рака ( Yang и др., 2011 ). JKF6 клетки специфически распознают комплекс MART-1-пептида и HLA-A * 02:01 молекулы, которые могут быть обнаружены с помощью MART-1-тетрамер с помощью проточной цитометрии ( рис 1 А).

 

MART-1-специфические Т - клетки трансдуцированных с Яманака факторы , используя тот же подход , как показано на рисунке S1 C. Примерно 20 колоний были получены от 5 × 10 5 клеток JKF, и мы подобрали 10 колоний из них. Среди них два были проанализированы на перегруппировки состояния гена цепи TCR & beta ; , и оба были найдены нести переставить конфигурацию гена , который был таким же , как та , что в клетках JKF. В дальнейшем мы сосредоточимся на одном из этих двух клонов, клон hi70-2, для дальнейших экспериментов. hi70-2 клетки образовали колонию , проявляющий чЭСК морфологию ( рис 1 б). hi70-2 клетки были положительными для TRA-1-60, TRA-1-81, Oct3 / 4, NANOG, SSEA3 и SSEA4 с помощью иммунофлуоресценции окрашивания ( рис 1 C). ОТ-ПЦР анализ показал , что hi70-2 клетки являются положительными для эндогенных Oct3 / 4 , SOX2 , KLF4 , и с-Мус , а также другие маркеры ESC, в то время как отрицательный для Т - клеточного маркера CD3ε ( рис 1 D). Мы также подтвердили потерю маркеров Т - клеток CD3 и CD8 с помощью проточной цитометрии ( рис 1 Е). SeV происхождения Oct3 / 4 , SOX2 , KLF4 , с-Мус , или SV40 не было выражено в этих клетках ( рис 1 F). Глобальный анализ экспрессии генов с помощью микрочипов показали большее сходство между hi70-2 клетками и ЭСК , чем оригинальные ЦТК ( рис 1 G). Кроме того , мы показали , что hi70-2 клетки способны образовывать тератомы с тремя зародышевых листков при подкожной инъекции голым мышам ( рис 1 H). Анализ кариотипа показал , что клетки не имеют хромосомные аномалии ( рис 1 I). Таким образом , мы пришли к выводу , что hi70-2 клетки представляют собой человеческие иПСК. Мы наконец исследовали перегруппировки статус TCRα и генов β цепных hi70-2 клеток и обнаружили , что они сохраняют ту же конфигурацию , как переставить оригинальные JKF6 клетки ( рис 1 J и 1К). Эти результаты показали , что MART-1-специфические Т - клетки были успешно перепрограммирован для ИПСК. Здесь и далее hi70-2 клетки обозначаются как "MART-1-ИПСК."

 

Для того, чтобы изучить вопрос о MART-1-иПСК способны дифференцироваться в зрелые Т - клетки, мы культивировали их с OP9 , а затем с OP9 / стромальных клеток Dll1 , как описано в рисунке S2 A. В качестве контроля, ЭСК, HCB-ИПСК и hCD8-ИПСК были также культивируют. Во всех четырех группах, CD34 + CD43 + клеток, представляющих очень ранние гемопоэтические клетки - предшественники ( Vodyanik и др., 2006 ), были получены на 13 -й день ( рис 2 А). В этот момент времени, CD34 + CD43 + клетки из всех четырех групп имели сравнимую способность производить миелоидных и эритроидных клеток в колониеобразующих анализа ( рисунок 2 Б).

 

На день 40, CD4 + CD8 + клетки DP генерировались во всех четырех группах (данные не показаны). Большинство клеток DP , генерируемых из MART-1-ИПСК выраженный TCR , специфичная для MART-1 эпитоп, хотя около 30% CD3 + клеток DP были отрицательными или только слабо положительной для MART-1-тетрамер окрашивания ( рис 2 С) ,

 

В физиологическом контексте, MART-1-специфические Т - клетки могут быть положительно выбраны тимуса кортикальных эпителиальных клеток , которые экспрессируют комплекс HLA-A * 02:01 и положительно отбора пептидных последовательностей отличных от MART-1 эпитоп. Тем не менее, с учетом современных технологий, трудно воспроизвести положительный отбор основан на перевязки MHC-TCR в системе монослой сокультивирования. При таком подходе, мы считаем , что более простая индукция будет достаточно, в частности , так как большинство клеток DP генерируется выражают TCR, специфичный для MART-1 эпитопа. SP клетки могут быть индуцированы из клеток DP с простым добавлением анти-CD3 антител даже при отсутствии TCR-MHC лигирования ( Takahama и др., 1994 ). Таким образом, мы добавили анти-CD3 мАт к культуре на 35 -й день, когда DP клетки уже имеется в изобилии. Количество CD8 + CD3 + MART-1 + клеток увеличилось на 300 раз по сравнению с 6 дней после стимуляции TCR ( рис 2 D). После стимуляции клетки DP начала уменьшаться на 1 -й день и были едва обнаружим по 3 -й день, когда популяции CD4 + и CD8 + Т - клеток , стала очевидной ( рис 2 E). На этот раз курс предполагает , что поколение CD4 + и CD8 + Т - клеток не за счет расширения уже существующих зрелых Т - клеток , но вместо того, чтобы к индукции созревания из DP в SP Т - клеток. На 6 -й день CD4 + Т - клетки исчезли , а количество CD8 + Т - клеток дополнительно увеличена ( Рисунок 2 F, средняя панель). В контрольных образцах нестимулированных клетки остались практически без изменений ( Рисунок 2 F, левая панель). Важно отметить, что в результате CD8 + Т - клетки были почти исключительно специфическими для MART-1 эпитоп ( Рисунок 2 F, правая панель). Мы получили аналогичные результаты в девяти независимых экспериментах ( рис 2 G). Анализ последовательности TCRα цепи мРНК в регенерированных CD8SP Т - клеток в одном из этих экспериментов подтвердили , что значительное большинство регенерированных CD8SP клеток несут один и тот же ген TCRα цепи в качестве оригинального MART-1-ИПСК ( рис 2 H). В противоположность этому , клетки CD8SP индуцированные из hCD8-ИПСК не выражают практически не MART-1-тетрамер + клеток ( рис 2 I).

 

Мы также исследовали , могут ли сформированные клетки CD8SP функционально зрелыми. MART-1 + CD3 + CD8 + Т - клетки выделяли с помощью клеточного сортера и стимулировали с помощью шариков , покрытых смесью анти-CD3 монАТ и анти-CD28 мАт. Производство IFN & gamma ; с помощью CD8 + Т - клеток , был обнаружен после этого CD3 / CD28 - стимуляции, а также производство IFN & gamma ; было синергически усиливается добавлением ГИП-2 ( рисунок 2 J). Для того, чтобы исследовать ли CD8 + Т - клетки могут быть активированы в антиген-специфическим образом, они были культивируют совместно с EBV-лимфобластоидная клеточной линии человеческого экспрессирующих HLA-A * 02:01 с или без MART-1-пептида в течение 24 ч. В CD8 + Т - клетки получают значительное количество IFN & gamma ; в присутствии специфического пептида ( рис 2 К). Таким образом, этот Ipsc подход представляется эффективным для регенерации функциональных антиген-специфических ЦТЛ.

 

Важно отметить , что доля MART-1-специфических Т - клеток в CD3 + клеток популяции составляет около 70% -80% в клетках DP, но он стал более чем 95% в CD8 + Т - клеток. Известно , что клетки DP переставить их гены TCRα цепь , в несколько раз , если они получают положительно или отрицательно выбран ( Питри и др., 1993 ). Таким образом, вполне вероятно , что MART-1-тетрамер отрицательные / низкие клетки в клетках DP ( Рисунок 2 C) представляют собой клетки , в которых унаследовали ген Vα-Jα был удален путем дальнейшей перегруппировки. Почему, в таком случае , MART-1-тетрамер + клетки в конечном итоге преобладают в CD8 + Т - клеток? Одно из объяснений может исходить от дифференциальной устойчивости спаривания TCRα и бета цепей; клетки , которые образовали новый TCR, заменив оригинальный TCRα цепь не может быть в состоянии конкурировать с Т - клетками , несущими унаследованное TCR.

 

Подводя итог, мы добились успеха в расширении антиген-специфических Т - клеток путем ИПСК из Т - клеток , и отличающим их обратно в Т - клетки. Необходимы дальнейшие исследования , чтобы определить , являются ли эти регенерированные зрелые Т - клетки могут убивать раковые клетки в пробирке или в естественных условиях. Он также может быть возможным разработать стратегию , которая исключает необходимость получения зрелых Т - клеток в пробирке. Одна идея состоит в том, чтобы производить Т - клеточных предшественников из антиген-специфичных ИПСК и передавать их пациентам, ожидая , что переданные клетки - предшественники Т - клеток будет мигрировать в тимусе и производят большое количество наивных ЦТЛ , которые являются специфическими для опухолевого антигена. Вдоль этих линий, мы разработали систему сокультивирования с использованием мышиных стромальных клеток , которые могут быть использованы для расширения клетки - предшественники Т - клеток , индуцированные из человеческих гемопоэтических стволовых клеток ( Кроткая и др., 2010 ). Мы также разработали фидерной системой , свободной от культуры , которая позволяет расширить мыши ранние клетки - предшественники Т - клеток в почти безграничным моды ( Ikawa и др., 2010 ). Если такой подход является эффективным, большое количество наивных ЦТЛ , несущих опухоль-антиген-специфического TCR может быть сгенерирован в естественных условиях у пациента. Таким образом, путем иммунизации пациента с опухолевым антигеном, мы могли бы ожидать увидеть сильные и продолжительный иммунный ответ на опухоль.

 

 

 

 

 

 

[ForestTrueno]

Помню до CRISPR Cas9 генная инженерия тоже развивалась. И думаю появятся инструменты еще лучше.