Как посчитать тромбоциты после разморозки?

[Екатерина17]

Подскажите метод как посчитать число тромбоцитов после разморозки? Плазму центрифугировали, осадок тромбоцитов заморозили, в крови их не считали... Наши биохимики говорили, что нужно лизировать тромбоциты аликвотой и посчитать по белку, но процедуру эту не знают... По какому белку считать и как это сделать? Спасибо! 

[Митя]

Подозреваю, что они предлагают считать количество тромбоцитов в крови, исходя из содержания белка в лизате, при известном содержании белка в тромбоцитах. Наверное, можно использовать для этого определение общего белка по Лоури, но цифры будут приблизительные. Как получить лизат - гугл в помощь. Наверное, это делается многократным замораживанием/размораживанием, либо Тритоном попробовать. В идеале, конечно, надо бы сравнить этот метод с микроскопированием, чтобы знать, насколько он точен.

[birg77out]

Это ответы нейросети.

ChatGPT

 

Для определения числа тромбоцитов после разморозки осадка тромбоцитов можно использовать метод флуоресцентной микроскопии с помощью маркера, специфичного для тромбоцитов. Один из таких маркеров - маркер флуоресценции CD41 (также известный как GPIIb или integrin αIIb), который является поверхностным белком, характерным для тромбоцитов.

Для определения числа тромбоцитов по белку CD41 после разморозки, следуйте примерно следующим шагам:

1. Разморозьте осадок тромбоцитов, предварительно помещенный в жидкостью азот, в термостате при комнатной температуре или в холодильнике.

2. Лизируйте тромбоциты с помощью соответствующего буфера (например, тридистиллированной воды) и инкубируйте при определенной температуре и времени для разрушения клеточных мембран.

3. После лизирования произведите центрифугирование, чтобы удалить клеточные остатки.

4. Полученный осадок тромбоцитов используйте для окрашивания маркером флуоресценции CD41. Вы можете использовать моноклональные антитела CD41, помеченные флуорофорами, для определения числа тромбоцитов.

5. Проведите анализ методом флуоресцентной микроскопии и считайте число маркированных тромбоцитов.

Этот метод позволяет определить число тромбоцитов, так как CD41 является характерным маркером для этих клеток. Однако важно помнить, что для проведения таких экспериментов требуется определенная экспертиза в области лабораторной работы и микроскопии, а также доступ к необходимому оборудованию и реактивам. Если в вашей лаборатории нет опыта работы с маркерами флуоресценции и микроскопией, рекомендуется проконсультироваться с квалифицированным биологом или биохимиком.

 

 

А если метод флуоресцентной микроскопии недоступен?

 

 

ChatGPT

 

Если метод флуоресцентной микроскопии недоступен, можно использовать другие методы для определения числа тромбоцитов. Один из возможных методов - это использование автоматических гематологических анализаторов, которые широко применяются в клинической практике для подсчета различных типов клеток в крови, включая тромбоциты.

В этом случае, после размораживания осадка тромбоцитов и лизирования, можно взять образец и использовать гематологический анализатор для подсчета числа тромбоцитов. Эти анализаторы автоматически считают клетки, опираясь на их размер и форму, и позволяют быстро получить результаты.

Если доступ к автоматическому гематологическому анализатору также ограничен, можно воспользоваться методом обратной фазовой микроскопии. В этом методе, после лизирования тромбоцитов и центрифугирования, можно подготовить мазок из осадка и провести его анализ с помощью микроскопа с обратной фазовой оптикой. Тромбоциты будут видны в мазке, и можно будет провести их подсчет в определенных областях.

Однако стоит учитывать, что методы подсчета числа тромбоцитов без специального оборудования могут быть менее точными и занимать больше времени. Поэтому, если возможно, стоит обратиться за помощью к специалистам или использовать доступное оборудование для более точных результатов.

 

 

А если проводить работу методом обратной фазовой микроскопии недоступна тоже?

 

 

ChatGPT

 

Если обратная фазовая микроскопия тоже недоступна, можно попробовать использовать другие методы, которые не требуют специального оборудования для определения числа тромбоцитов. Одним из таких методов является использование метода определения количества тромбоцитов по их агрегации (склеиванию).

Метод агрегации тромбоцитов основан на том, что при их активации они начинают слипаться и образовывать агрегаты. С помощью определенных реагентов, которые способствуют активации тромбоцитов, можно индуцировать агрегацию и затем определить количество образовавшихся агрегатов. Этот метод позволяет получить оценку числа тромбоцитов в образце.

Еще одним методом, который можно использовать без специального оборудования, является использование коммерчески доступных тест-полосок или тест-картриджей для быстрого определения числа тромбоцитов. Такие тесты основаны на различных реакциях между тромбоцитами и реагентами, что приводит к изменению цвета или образованию специфических линий на тест-полоске. Это позволяет быстро получить приблизительное значение числа тромбоцитов.

Однако стоит отметить, что методы, которые не требуют специального оборудования, могут быть менее точными и не предоставлять полного представления о состоянии тромбоцитов в образце. Важно также учитывать, что результаты этих методов следует интерпретировать с осторожностью и лучше всего обратиться за помощью к квалифицированным специалистам для более точной оценки числа тромбоцитов и их состояния.

 

Можно ли использовать для этого определение общего белка по Лоури?

 

ChatGPT

Да, определение общего белка по методу Лоури может быть одним из вариантов для оценки количества тромбоцитов. Однако следует отметить, что это будет приблизительная оценка, так как метод Лоури измеряет общее содержание белка в образце и не дает точной информации о числе тромбоцитов.

Метод Лоури основан на реакции белка с реагентами, такими как реактив Фолина-Кокса, что приводит к образованию комплексов, которые имеют характеристический цвет. Измеряя интенсивность цвета, можно определить количество белка в образце.

Если выбрать этот метод для определения количества тромбоцитов, то необходимо помнить, что общий белок включает не только тромбоциты, но и другие компоненты крови и тканей, такие как плазма, лейкоциты, эритроциты и т. д. Поэтому результаты будут влияние другими клетками и белками.

Для более точного определения числа тромбоцитов рекомендуется использовать специфические методы, такие как счетчик кровяных клеток или метод агрегации тромбоцитов, как упоминалось выше. Эти методы позволяют более точно оценить количество тромбоцитов и получить информацию о их функциональных характеристиках.

Изменено 28 Июля, 2023 в 21:51 пользователем birg77out

[birg77out]

Екатерина17, хотелось бы, чтобы Вы написали, будете ли Вы продолжать работу в этом направлении или уже выполнили её? Если да, то как?

[Екатерина17]

В 30.07.2023 в 18:36, birg77out сказал:

Екатерина17, хотелось бы, чтобы Вы написали, будете ли Вы продолжать работу в этом направлении или уже выполнили её? Если да, то как?

Добрый день! Работу уже выполняли. К плазме, обогащенной тромбоцитами, добавляли 500 мкл 0.1Н хлорной кислоты с внутренним стандартом 1000 пмол/мл ДГБА. Пробы гомогенизировали на льду с помощью ультразвукового  гомогенизатора 10 сек.  1.5 мкл пробы использовали для концентрации белка методом Pierce BCA Protein Assay Kit.