Определение белков

[Sinnerman]

Уже неделю ищу методику количественного определения белков на основе нингидриновой реакции. У кого-нибудь имеется таковая?

 

Спасибо громадное.

[Phenil]

Уже неделю ищу методику количественного определения белков на основе нингидриновой реакции. У кого-нибудь имеется таковая?

 

Спасибо громадное.

Могу сбросить Вам на E-mail методички

[Phenil]

Уже неделю ищу методику количественного определения белков на основе нингидриновой реакции. У кого-нибудь имеется таковая?

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

 

Как при выделении и очистке белков, так и при проведении разнообразных биохимических исследований необходимо количественное определение содержания белка в исследуемой фракции, в выделенном или исследуемом образце. Кроме того, анализ содержания белков в биологических жидкостях (крови) имеет важное биомедицинское значение и используется в диагностических целях. Количественное определение белка проводится, как правило, с небольшим количеством материала и требует высокочувствительных методов детекции.

Наиболее широко распространены колориметрические и спектрофотометрические методы количественного определения белка.

 

 

1.1. БИУРЕТОВЫЙ МЕТОД

 

Принцип метода. Метод основан на способности белков давать с раствором сернокислой меди фиолетовое окрашивание в щелочной среде. Для биуретовой реакции необходимо наличие двух ОН-групп и трех атомов азота, находящихся в полипептидной цепи. Группа, образующая пептидную связь (– ОС – NH –) в щелочной среде, присутствует в своей таутомерной форме. В избытке щелочи происходит диссоциация водорода енольной ОН-группы, при этом возникает отрицательный заряд, с помощью которого кислород, взаимодействуя с медью, образует соль; кроме того, медь образует дополнительные (дативные) связи с атомами азота пептидных связей. Возникший комплекс характеризуется высокой стабильностью.

Чувствительность данного метода позволяет определять белок в диапазоне концентраций от 2 до 10 мг в пробе.

 

Реактивы: 1. Раствор сывороточного альбумина, содержащий 10 мг белка в 1 мл (стандартный раствор).

2. Биуретовый реактив: 0,15 г СuSО4∙5Н2О и 0,6 г натрий-калия виннокислого (NаКС4Н4О6•4Н2О) растворяют в 50 мл Н2О, при энергичном перемешивании приливают 30 мл 10 % раствора NаОН, затем добавляют 0,1 г КI. Объем раствора доводят дистиллированной водой до 100 мл. Реактив хранят в парафинированной или полиэтиленовой склянке в течение 1 мес.

 

Ход работы. Для построения калибровочного графика из стандартного раствора альбумина готовят растворы белка, содержащие 2, 4, 6, 8 и 10 мг альбумина в 1 мл. В каждую пробирку, содержащую 1 мл раствора белка соответствующего разведения добавляют 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют оптическую плотность раствора на ФЭК при 540 нм в 1 см кювете.

На каждую точку проводят два определения, для построения калибровочного графика используют среднее арифметическое.

Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику.

[Sinnerman]

Буду очень признателен. Биуретовая реакция не подходит. Дело в том, что наша система представлена различными динамическими процессами гидролиза белка ферментами с образованием пептидов различной длины. Биуретовая реакция по пептидным связям не даст нам нужной точности. Хотелось бы опробовать нингидрин.

[Sinnerman]

Может еще какой-нибудь метод подойдет?