Расщепление белка на суб'единицы

[Lyussy]

Здравствуйте! Хотелось бы очень узнать, если кто в теме, - как предотвратить спонтанную деградацию белка во время экспрессии. Буду премного благодарна за каждый совет! Больше года не могу найти ответ на этот вопрос.

[chemister2010]

Если я правильно понимаю термин, экспрессия белка - это его синтез на матричной РНК. Синтезируются отдельные субъединицы. Затем они объединяются. В чем ваша проблема?

[Lyussy]

Экспрессия - это ведь трансформация и выращивание трансформированых бактерии, которые произведут две суб'единицы, но во время выделения эти суб'единицы не держатся вместе. В этом проблема.

[Angry_Biotechnologist]

1 час назад, Lyussy сказал:

Экспрессия - это ведь трансформация и выращивание трансформированых бактерии, которые произведут две суб'единицы, но во время выделения эти суб'единицы не держатся вместе. В этом проблема.

Можно больше информации? Какой белок, из каких бактерий, какие субединицы?

 

Пока что выглядит так что у вас завелась некая структурная мутация (если нативный белок держался вместе, а теперь вдруг перестал) или же плохой выбор буфра

[Lyussy]

Протеин Polygalacturonaza (фермент), бактерия E.coli BL21 (DE3). Применительно к моей секвенции протеин должен быть 43kDa, но он расщепился, не знаю, почему, на размер 16-17kDa. 
В природе он имеет размер 47kDa и расщепляется на 28kDa.

[Angry_Biotechnologist]

21 час назад, Lyussy сказал:

Протеин Polygalacturonaza (фермент), бактерия E.coli BL21 (DE3). Применительно к моей секвенции протеин должен быть 43kDa, но он расщепился, не знаю, почему, на размер 16-17kDa. 
В природе он имеет размер 47kDa и расщепляется на 28kDa.

Если есть секвенция то сделайте 3д моделинг, можна будет глянуть на структуру и потенциально выяснить где что ламается https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/howto/view-3d-struct-prot/  или https://swissmodel.expasy.org/interactive (рекомедую).

 

Добавте еще параметры в которых у вас проходит експресия (кислотность, температура и растворитель), возможно проблема с ними. Вообще опишите что вы делали с ензимом, с чего изолировали как ставили в библиотеку/клонировали и т.п.

Сложный воопрос - мало информации

[Lyussy]

Расщепленный протеин получилось выделить, сейчас проверяю его на ImmunoCAP. Беда в том, что используемые стрептавидиновые ручки

уже 2 года как после срока годности. Вы случайно не знаете, можно ли и такие старые использовать?

[Angry_Biotechnologist]

22 часа назад, Lyussy сказал:

Расщепленный протеин получилось выделить, сейчас проверяю его на ImmunoCAP. Беда в том, что используемые стрептавидиновые ручки

уже 2 года как после срока годности. Вы случайно не знаете, можно ли и такие старые использовать?

Если были заморожены в -70  меньше то можно и скорее всего будет все ок. Но если не получится то причина будет ясна.