Реакция EDC и NHS друг с другом в воде без присутствия карбоновой кислоты

[Miriada]

Да, я знаю механизм. Методика разаработана не мной, я просто ее воспроизводила. 
Суть в том, что аналитические методы такие как SDS-PAGE, NMR, HPLC показывают, что конъюгация протекает с очень низкой эффективностью, практически нулевой, но проблема не в этом даже. Я пытюсь понять, какие два побочных продукта образуется из инсулина. 

[Miriada]

Ситуация такая, что HPLC UV показыват три пика, один - это чистый инсулин (и он точно не связан с наночастицами) + еще два пика - две дополнительные модификации инсулина. И я пытаюсь понять, что это. 

Мне удалось показать, что эти две модификации обусловлены наличием EDC и NHS. Если их убрать из реакции, два побочных продукта просто исчезают! 

На самом деле, учитывая, что эффективность конъюгации в этих условиях практически нулевая, NHS и EDC здесь вообще не нужны. Более того, когда я убираю наночастицы из реакции, получается абсолютно тот же резултат - я вижу три пика на HPLC.
 

Также я вывела  следующие закономерности:

 

- При полном исключении EDC и NHS продукт становится чистым: на HPLC-UV наблюдается только один пик инсулина, обе примеси полностью исчезают.

 

- При снижении загрузки EDC и NHS в 2 раза концентрация чистого инсулина увеличивается на 50%, концентрация первого побочного продукта снижается на 50%, а второго — на 38%.

 

- Добавление EDC и NHS в заранее охлаждённую до 4 °C воду для активации карбоксильных групп увеличивает концентрацию чистого инсулина на 5%, и также увеличивает концентрацию основного побочного продукта — на 10%.

 

- После активации карбоксильных групп на наночастицах рН раствора доводится до 10, затем добавляется раствор инсулина. Если инсулин добавлять быстрее, чем обычно, его содержание в конечном продукте увеличивается, а концентрация примесей снижается (эффект боле быстрого разбавления?).

 

- Если в воду сначала добавляется NHS, а затем EDC, концентрация чистого инсулина в продукте увеличивается на 35%, а концентрация основного побочного продукта снижается на 17%, а второго побочного продутка - на 26% даже без уменьшения загрузок NHS и EDC.

 

- При снижении pH с 10 до 8.5 концентрация инсулина увеличивается примерно на 12%, но основная примесь возрастает на 30%.

 

Я думаю, что контрольные эксперименты только с EDC и только с NHS могут помочь сузить круг поиска, хотя, скорее всего, именно их комбинация приводит к модификациям пептида.

В общем, я пытаюсь понять, как EDC и NHS могут модифицировать пептид и вообще, почему это происходит 

Изменено 22 Июня, 2025 в 08:47 пользователем Miriada

[ash111]

Что тут я бы исследовал и что мне не очень ясно

 

1) чем крепится тиопропионовая к наночастицам? через меркапто-группу? в чем раствор наночастиц? я так понял, в воде?

2) из описания процесса тобой понятно что видимо не успевает образоваться тот самый NHS-сложный эфир с меркаптопропионовой кислотой. Я бы попробовал подольше подержать до добавления буфера, возможно даже погреть.

Если этот сложный эфир образовался то по идее дальше вода или буфер ему не вредят, а реагирует он с самым нуклеофильным что есть в среде - то есть с инсулиновыми аминогруппами.

3) можно попробовать другой агент для этого каплинга - их много. Тот же HATU, BOP, PyBOP и прочее такое.

ну и конечно неводная среда для первого этапа, до добавления буфера и инсулина, возможно решила бы вопрос. ДМФА, ДМАА, ДМСО - чтото такое. Биологи секвенируют всякие белки легко и воспроизводимо, может у них взять методику)

В 22.06.2025 в 11:46, Miriada сказал:

две дополнительные модификации инсулина

А какой молекулярный вес у этих двух модификаций? можно сделать HiRes ESI или чтото такое? тогда можно было бы предполагать куда увереннее

[Miriada]

Ag₂S QD synthesis

Ag₂S QD synthesis has been previously described^23,24. Briefly, 25.6 mg of silver diethyldithiocarbamate and 12 ml of 1-dodecanethiol were mixed with a created N₂ vacuum followed by an Ar vacuum. The solution was heated to 200 °C (12 °C min^–1) and held for 1 h. Following synthesis, EtOH was added (88 ml) followed by centrifugation (3,220 g, 0.5 h). Ag₂S QDs were resuspended in cyclohexane, washed twice with EtOH followed by repeat centrifugation (3,220 g, 0.5 h). Aqueous phase transfer was performed with QDs suspended in a 1:1 (v/v) mixture of cyclohexane/acetone. Then, 1 ml of 3-MPA was added per 25 mg of Ag₂S QDs and mixed at room temperature for 1 h. The QDs were mixed with EtOH and centrifuged at 1,811 g for 5 min. The pellet was redispersed in Milli-Q (MQ) water, washed with EtOH twice and dispersed in MQ water and lyophilized.

CS/GS copolymer

CS/GS copolymer was produced by combining 5 mg ml^–1 chitosan with 10% glacial acetic acid in MQ. Under gentle mixing, the solution was heated to 50 °C for 1 h until chitosan dissolved. Then, 2.5 mg ml^–1 glucose was added to the solution and mixed for 1 h at 50 °C. The solution is allowed to cool to room temperature (0.5 h) and then dialysed in 10 kDa MQ water for 2, 4 and 16 h at room temperature. The solution was diluted to 10 mg ml^–1 and pH 5 and stored at 4 °C in the dark until use.

Ag₂S QD conjugation to insulin

For 1 ml of 1.3 mg ml^–1 QD-INS (36 IU ml^–1), combine 17.5 µg Ag₂S QDs with 1.862 mg EDC and 2.000 mg NHS in 425 µl MQ water and mix for 1 h at 4 °C. Prepare a 100× carbonate–bicarbonate buffer (1.05 mg sodium bicarbonate, 9.27 mg sodium carbonate (anhydrous), 100 µl MQ water). Adjust the solution to pH 9 (add 7.5 µl 100× carbonate–bicarbonate buffer to the QD–EDC–NHS mixture and mix for 2 min). Prepare 2.18 mg insulin human recombinant in 250 µl MQ water with 2 µl of 1 M HCl until dissolved. Add all the dissolved insulin solution slowly to the QD–EDC–NHS mixture (clear solution, if successful) and mix for 4 h. The solution was then dialysed with 10 kDa in MQ for 2, 4 and 16 h at 4 °C. The solution was stored at pH 7 and 4 °C in the dark until use or lyophilized for longer-term storage.

QD-INS coating with CS/GS

For 1 ml of 1.3 mg ml^–1 QD-INS–CS/GS, 1 ml clear QD-INS was slowly combined with 20 µl CS/GS polymer stock (10 mg ml^–1). The clear solution was mixed for 10 min at 4 °C and stored in the dark until use. QD-INS–CS/GS will precipitate in MQ water at a pH of <6, centrifuge at 2,465 g for 15 min at 4 °C, remove the supernatant and resuspend at the desired concentration or freeze dry to form a powder (~1.3 mg final volume).

https://www.nature.com/articles/s41565-023-01565-2

[ash111]

В 22.06.2025 в 11:46, Miriada сказал:

когда я убираю наночастицы из реакции, получается абсолютно тот же резултат - я вижу три пика на HPLC.

в инсулине совершенно явно есть какие-то карбоксильные группы - аспарагиновая или глутаминовая кислота. Вот они дают тебе NHS- эфиры, которые ты и видишь. ТОлько они нестойкие и гидролизуются постепенно поэтому через время ты видишь опять чистый инсулин. Возможно такое?

В 22.06.2025 в 11:55, Miriada сказал:

Ag₂S QD synthesis

Ag₂S QD synthesis has been previously described^23,24. Briefly, 25.6 mg of silver diethyldithiocarbamate and 12 ml of 1-dodecanethiol were mixed with a created N₂ vacuum followed by an Ar vacuum. The solution was heated to 200 °C (12 °C min^–1) and held for 1 h. Following synthesis, EtOH was added (88 ml) followed by centrifugation (3,220 g, 0.5 h). Ag₂S QDs were resuspended in cyclohexane, washed twice with EtOH followed by repeat centrifugation (3,220 g, 0.5 h). Aqueous phase transfer was performed with QDs suspended in a 1:1 (v/v) mixture of cyclohexane/acetone. Then, 1 ml of 3-MPA was added per 25 mg of Ag₂S QDs and mixed at room temperature for 1 h. The QDs were mixed with EtOH and centrifuged at 1,811 g for 5 min. The pellet was redispersed in Milli-Q (MQ) water, washed with EtOH twice and dispersed in MQ water and lyophilized.

CS/GS copolymer

CS/GS copolymer was produced by combining 5 mg ml^–1 chitosan with 10% glacial acetic acid in MQ. Under gentle mixing, the solution was heated to 50 °C for 1 h until chitosan dissolved. Then, 2.5 mg ml^–1 glucose was added to the solution and mixed for 1 h at 50 °C. The solution is allowed to cool to room temperature (0.5 h) and then dialysed in 10 kDa MQ water for 2, 4 and 16 h at room temperature. The solution was diluted to 10 mg ml^–1 and pH 5 and stored at 4 °C in the dark until use.

Ag₂S QD conjugation to insulin

For 1 ml of 1.3 mg ml^–1 QD-INS (36 IU ml^–1), combine 17.5 µg Ag₂S QDs with 1.862 mg EDC and 2.000 mg NHS in 425 µl MQ water and mix for 1 h at 4 °C. Prepare a 100× carbonate–bicarbonate buffer (1.05 mg sodium bicarbonate, 9.27 mg sodium carbonate (anhydrous), 100 µl MQ water). Adjust the solution to pH 9 (add 7.5 µl 100× carbonate–bicarbonate buffer to the QD–EDC–NHS mixture and mix for 2 min). Prepare 2.18 mg insulin human recombinant in 250 µl MQ water with 2 µl of 1 M HCl until dissolved. Add all the dissolved insulin solution slowly to the QD–EDC–NHS mixture (clear solution, if successful) and mix for 4 h. The solution was then dialysed with 10 kDa in MQ for 2, 4 and 16 h at 4 °C. The solution was stored at pH 7 and 4 °C in the dark until use or lyophilized for longer-term storage.

QD-INS coating with CS/GS

For 1 ml of 1.3 mg ml^–1 QD-INS–CS/GS, 1 ml clear QD-INS was slowly combined with 20 µl CS/GS polymer stock (10 mg ml^–1). The clear solution was mixed for 10 min at 4 °C and stored in the dark until use. QD-INS–CS/GS will precipitate in MQ water at a pH of <6, centrifuge at 2,465 g for 15 min at 4 °C, remove the supernatant and resuspend at the desired concentration or freeze dry to form a powder (~1.3 mg final volume).

https://www.nature.com/articles/s41565-023-01565-2

Это наночастицы - сульфид серебра?

[Miriada]

В 22.06.2025 в 18:55, ash111 сказал:

в инсулине совершенно явно есть какие-то карбоксильные группы - аспарагиновая или глутаминовая кислота. Вот они дают тебе NHS- эфиры, которые ты и видишь. ТОлько они нестойкие и гидролизуются постепенно поэтому через время ты видишь опять чистый инсулин. Возможно такое?

Эти две примеси, которые образуются очень селективно, достаточно стабильны! 

Примеси исчезают, только если я не использую NHS и EDC - это был контрольный эксперимент, чтобы показать, источник этих модификаций 

[ash111]

В 22.06.2025 в 11:46, Miriada сказал:

После активации карбоксильных групп на наночастицах рН раствора доводится до 10, затем добавляется раствор инсулина.

Это странно в процедуре. Я бы добавлял сначала инсулин, а потом уже доводил pH до 10. У тебя же побочно идет гидролиз того самого NHS-эфира с меркаптопропионовой, в результате чего пока там появится инсулин возможно уже активного там ничего не остается. Если только это не вредит всяким там первичным-вторичным-четвертичным структурам инсулина, я бы добавлял его первым, а потом подщелачивал. В химии это довольно обычная вещь.

[Miriada]

В 22.06.2025 в 19:01, ash111 сказал:

Это странно в процедуре. Я бы добавлял сначала инсулин, а потом уже доводил pH до 10. У тебя же побочно идет гидролиз того самого NHS-эфира с меркаптопропионовой, в результате чего пока там появится инсулин возможно уже активного там ничего не остается. Если только это не вредит всяким там первичным-вторичным-четвертичным структурам инсулина, я бы добавлял его первым, а потом подщелачивал. В химии это довольно обычная вещь.

Да, я тоже об этом думала. Вообще, pH достаточно высокий - NHS-эфиры быстро гидролизуются в таких условиях - но не я автор этой методики  и менять ее не могу   Мне нужно только убрать  две побочные фракции инсулина 

В 22.06.2025 в 18:55, ash111 сказал:

в инсулине совершенно явно есть какие-то карбоксильные группы - аспарагиновая или глутаминовая кислота. Вот они дают тебе NHS- эфиры, которые ты и видишь. ТОлько они нестойкие и гидролизуются постепенно поэтому через время ты видишь опять чистый инсулин. Возможно такое?

Это наночастицы - сульфид серебра?

Да, точнее, это квантовые точки 

Изменено 22 Июня, 2025 в 09:04 пользователем Miriada

[ash111]

В 22.06.2025 в 11:58, Miriada сказал:

Эти две примеси, которые образуются очень селективно, достаточно стабильны! 

Примеси исчезают, только если я не использую NHS и EDC - это был контрольный эксперимент, чтобы показать, источник этих модификаций 

Есть вариант попробовать просто EDC, без NHS. Просто EDC, сам по себе - тоже каплинг-агент, он применяется для получения амидов абсолютно нормально. Ну и опять же если он остается незадействованным с наночастицами, то он будет образовывать с инсулином устойчивые вот такие штуки

где звездочка и NH это остаток инсулина

[Miriada]

Молеклярные массы этих двух загадочных модификаций еще определяются. НО эти побочные продукты были выделены, очищены, разрушены на более мелкие пептиды с помощью трипсина и проанализированы методом масс-спектрометрии. Сравнение полученных результатов с базой данных дало такой результат для первого и главного побочного продукта -  это инсулин с присоединённой пропионильной группой по глицину (B23). Второй вариант - карбометилирование того же глицина (В23). Масса модификации 56–57 Da. - но это какие-то чудеса! И я не верю этим результатам. НЕ понимаю, как такое возможно вообще из-за NHS или EDC

Изменено 22 Июня, 2025 в 09:12 пользователем Miriada