Реакция EDC и NHS друг с другом в воде без присутствия карбоновой кислоты

[ash111]

В 27.06.2025 в 16:02, Miriada сказал:

EDC моментально гидролизуется в воде особенно при pH 10. 

нет, нет) вода довольно слабый нуклеофил, собственно именно поэтому у вас реакция в принципе может идти в водной среде, иначе бы оно просто с водой реагировало да и все. а pH10 это всего лишь 10^-4М концентрация ионов гидроксила, так что да, он может там еще вертеться некое время)

 

А на диализе там тоже есть какое-то характеристическое время выхода, я не в курсе? Потому что ну по идее у вас есть аминогруппы, есть карбоксилы и по идее может быть какоето сшивание молекулы инсулина внутри, которое происходит естетственно медленно и дает некую новую примесь. Но, тогда и молекулярный вес падает, а я помню что вы нашли +56-58Да привес в примесях - тогда конечно это не сшивание

 

В 27.06.2025 в 16:02, Miriada сказал:

И я не могу понять, если за первый цикл концентрация инсулина уменьшилась на 15%, то как возможно, что количество одного побочного продукта увеличилось на 40% и второго на 55% - это ведь модификации инсулина

так а как вы оцениваете общую концентрацию инсулина? есть корреляция между интенсивностью пика и концентрацией?

[Miriada]

В 28.06.2025 в 19:21, ash111 сказал:

так а как вы оцениваете общую концентрацию инсулина? есть корреляция между интенсивностью пика и концентрацией?

Концентрация инсулина определяется с помощью калибровочной кривой, построенной с использованием стандарта инсулина (HPLC-UV метод).

 

Концентрации двух побочных модификаций не могут быть определены в настоящее время (структуры пока не идентифицированы полностью).

Но чтобы отслеживать, как изменение реакционных условий влияет на соотношение между разными фракциями инсулина, я сравниваю AUC (area under curve). То есть, если в контрольном эксперименте у нас сигнал примеси составлял 300 000, а при изменении какого-то параметра он стал 400 000, то я могу видеть, что содержание примеси увеличилось на 33% (при условии, что анализ проводился в идентичных условиях). Хотя здесь мы также принимаем, что отклик для этих побочных инсулиновых фракций линейный

В 28.06.2025 в 19:21, ash111 сказал:

А на диализе там тоже есть какое-то характеристическое время выхода, я не в курсе? Потому что ну по идее у вас есть аминогруппы, есть карбоксилы и по идее может быть какоето сшивание молекулы инсулина внутри, которое происходит естетственно медленно и дает некую новую примесь. Но, тогда и молекулярный вес падает, а я помню что вы нашли +56-58Да привес в примесях - тогда конечно это не сшивание

Я изменю режим диализа на single-pass mode, тогда EDC HCl вымоется эффективнее - если гипотеза верна, это поможет остановить побочные реакции внутри диализной системы. Просто удивительно, что реакции могут дальше идти, я на 2 литра водной реакционной массы беру 100 литров воды на рециркуляцию (это только на первый цикл диализа). 

[Miriada]

Исходя из Вашего опыта, какой порядок добавления реагентов предпочтительнее?

 

Обычно EDC HCl добавляют первым, но в литературе также часто встречается, что сначала добавляют NHS; кто-то предварительно растворяет NHS и EDC в воде и вводит их в виде растворов, а кто-то добавляет их в виде порошков.

 

Я спрашиваю, потому что мои дополнительные эксперименты показали, что добавление NHS первым или одновременно с EDC приводит к увеличению концентрации немодифицированного инсулина и снижению концентрации инсулинов, модифицированных EDC. Это может быть связано с более быстрым и эффективным образованием NHS-эфиров, либо с тем, что часть EDC просто реагирует с NHS без образования эфиров. А чем больше EDC тратится на на образование NHS-эфиров и реакции с NHS, тем меньше остаётся его для модификации инсулина.

[ash111]

В 30.06.2025 в 10:53, Miriada сказал:

с тем, что часть EDC просто реагирует с NHS без образования эфиров.

и потом гидролизуется водой в мочевину, ну да) такие процессы более чем известны

[Miriada]

В 05.07.2025 в 19:47, ash111 сказал:

и потом гидролизуется водой в мочевину, ну да) такие процессы более чем известны

Я знала о непосредственном гидролизе EDC  с образованием мочевины, но не знала, что EDC может просто реагировать с NHS - собственно этот вопрос и положил начало данному обсуждению. 

В 22.06.2025 в 18:14, ash111 сказал:

Cначала получается вот такое

 

и потом этот аддукт гидролизуется, как один из вариантов 

Изменено 6 Июля, 2025 в 08:52 пользователем Miriada

[ash111]

В 06.07.2025 в 11:50, Miriada сказал:

Я знала о непосредственном гидролизе EDC  с образованием мочевины, но не знала, что EDC может просто реагировать с NHS - собственно этот вопрос и положил начало данному обсуждению. 

и потом этот аддукт гидролизуется, как один из вариантов 

NHS сам по себе кислый достаточно. А если такая протонная среда как вода, то он видимо просто диссоциирует и получается такая же частица нуклеофильная как карбоксилат..

Я говорю "видимо", потому что это надо проверять, зачастую реакции в органике логичны и законны, но в плане условий их протекания есть нюансы) иногда очень существенные нюансы даже на близких аналогах того, что точно идет в известных условиях)

Собственно чего я рассказываю, вы сами к этому прикоснулись уже в хорошей мере))

[Miriada]

Причиной появления обоих побочных продуктов, как и ожидалось, является именно EDC. В присутствии одного EDC, концентрация инсулина падает абсолютно так же как и при стандартных условиях с EDC и NHS. Из этого я делаю вывод, что в этой конъюгации EDC, котрый не успел гидролизоваться, тратится на побочные реакции, а не на конъюгацию инсулина. (Что-то происходит тут с NHS-эфирами, видимо, все-таки по такой процедуре они разрушаются, pH 10 достаточно высокий для них).
 

В присутствии одного NHS побочных продуктов не образуется, а концентрация инсулина в образце максимальна - то есть мы видим весь инсулин, добавленный к наночастицам.
 

Однако при участии NHS образование основной примеси ускоряется, в то время как образование второй замедляется, если сравнивать эксперименты с одним EDC и эксперименты, где соотношение EDC:NHS увеличено до 1:5.

Изменено 6 Июля, 2025 в 12:11 пользователем Miriada

[Miriada]

Количество побочных продуктов инсулина уменьшается пропорционально количеству добавленного EDC/NHS.

Кроме того, предварительное введение NHS перед EDC помогает снизить образование побочных продуктов.

 

Однако если NHS добавляется первым или общая загрузка EDC/NHS снижается слишком сильно, коллоидная система становится менее стабильной - частицы становятся менее растворимыми в воде и начинают агрегировать.

 

Наночастицы, покрытые 3‑меркаптопропионовой кислотой, обычно стабильны в воде, особенно при высоком pH, поскольку карбоксильные группы в этом случае заряжены отрицательно. Первое, что приходит на ум при выпадении частиц в осадок, - образование NHS‑эфиров: поверхность становится нейтральной и частицы теряют стабильность.

Однако неясно, почему при высокой загрузке EDC/NHS относительно инсулина частицы остаются хорошо диспергированными (раствор прозрачен), и почему при добавлении NHS первым они всё равно агрегируют.

 

Но тут есть еще одно противоречие - стабильность коллоидной системы нарушается, даже если я вообще не добавляю EDC и NHS. А это значит, что инсулин может влиять на эту стабильность. При этом мы знаем, что конъюгация, если мы следуем данной нам процедуре, не работает, но значит NHS и EDC все равно как-то влияют на частицы.

 

Может ли здесь быть какое‑то рациональное объяснение? Пока ничего не нашла в литературе.

[ash111]

В 06.07.2025 в 13:47, Miriada сказал:

Количество побочных продуктов инсулина уменьшается пропорционально количеству добавленного EDC/NHS.

Кроме того, предварительное введение NHS перед EDC помогает снизить образование побочных продуктов.

 

Однако если NHS добавляется первым или общая загрузка EDC/NHS снижается слишком сильно, коллоидная система становится менее стабильной - частицы становятся менее растворимыми в воде и начинают агрегировать.

 

Наночастицы, покрытые 3‑меркаптопропионовой кислотой, обычно стабильны в воде, особенно при высоком pH, поскольку карбоксильные группы в этом случае заряжены отрицательно. Первое, что приходит на ум при выпадении частиц в осадок, - образование NHS‑эфиров: поверхность становится нейтральной и частицы теряют стабильность.

Однако неясно, почему при высокой загрузке EDC/NHS относительно инсулина частицы остаются хорошо диспергированными (раствор прозрачен), и почему при добавлении NHS первым они всё равно агрегируют.

 

Но тут есть еще одно противоречие - стабильность коллоидной системы нарушается, даже если я вообще не добавляю EDC и NHS. А это значит, что инсулин может влиять на эту стабильность. При этом мы знаем, что конъюгация, если мы следуем данной нам процедуре, не работает, но значит NHS и EDC все равно как-то влияют на частицы.

 

Может ли здесь быть какое‑то рациональное объяснение? Пока ничего не нашла в литературе.

Это потрясающий детектив, интересно на какой его странице Мисс Марпл признает признает наконец метод неудачным и будет искать альтернативы 🤭

 

Не хочу вас както обидеть, но, вот смотрите, вы подробно эту систему изучаете. Допустим вы поймете что и за что отвечает, что с чем взаимодействует и какие продукты получаются. Поможет ли это добиться в результате того, что инсулин таки заамидирует ту меркаптопропионовую квантовую точку?) Как по мне - сомнительно, напомните, вы вообще-то видели хоть гдето эти продукты?)

У вас очень много энергии и мотивации к исследованиям, это здорово, но я беспокоюсь что все это пропадет когда выяснится простая вещь - что надо как-то иначе всю эту процедуру проводить, а время было потрачено на один-единственный метод. Диверсифицируйте ваши исследования, благо эта химия дает довольно неплохой выбор методов)

Органическая химия это такая штука где фундаментальность знаний важна, разумеется, но люди никогда не пытаются упереться в один подход, стараясь накопить информацию более широкого спектра)