Как приготовить калибровочные растворы и какие лучше методики определение липидов?

[vagus]

Необходимо происследовать сыворотку крови.

Определить общие липиды, фосфолипиды, триацилглицериды, бето-липопротеиды, общий холестерин и сиаловые кислоты.

Реактивы для общих липидов есть но нет калибровочного раствора (хотел провести риакцию с фосфорнованилиновым реактивом) там стандартный раствор идет триолеин. Но вычитал в одной книге что как я понял можно использовать профильтрованное сливочное масло --- "стандартный раствор в хлороформе триолеина или холестерина (х. ч.) со свежим топленым и профильтрованным сливочным маслом в соотношении 1: 3 или общие липиды". Но сейчас такое масло... да и если вдруг оно будет подкрашено каротином, для товарного вида, по будет наверно давать на ФЕК погрешность. Поэтому не знаю какое масло лучше выбрать. Мне кажется в идеале вообще было бы рафинированное растительное. Оно и чище и работать с ним удобнее. Но во первых до конца не разобрался в сути реакции, а во вторых не знаю на сколько сильно отличается рафинировано растительное масло от сливочного и тем более от стандартного раствора триолеина. Проверить не как. Подскажите кто знает, что можно использовать в качестве стандарта?

Фосфолипиды не знаю какой методикой лучше определят, и опять же наверно понадобится стандартный раствор. Хотел по методу Бартлетту—Ушеру но какой то он сомнительный определение по неорганическому фосфору… А если в сыворотке будет другой фосфор тоже неорганический, но не из фосфолипидов, это же даст погрешность? Или нет?

В-липопротеиды (по Бурштейну в модификации Виноградовой) думаю самый легкий и хороший способ, только правда геппарин дороговат, но его надо мало так что с этим разобрался

Триацилглицериды тоже не знаю как лучше, чтоб без дорогих реактивов, и не нашел методику получения калибровочного раствора

Общий холестерин хотел определить по Ильку но опять же нужен стандарт. Может его из чего то можно выделить

Сиаловые кислоты вроде не нужно дорогих реактивов но получение стандарта это ужас, нужен мозг крысы, надо проводить диализ 2а дня, и еще куча заморочек.

Так что подскажите пожалуйста кто знает хорошие методики, без дорогих реактивов, и приготовление стандартов, или если можно без стандартного раствора так как в методике с бета-липопротеидами?

[ksanf]

Что-то у Вас методы по ТАГ и ХС древние. Для сыворотки давно созданы приличные наборы реактивов с ферментативным определением искомого вещества. Они просты, точны и по-моему не дорогие. Как пример, не сочтите за рекламу, наборы от "Вектор-Бест" в Новосибирске. Есть и другие подобные.

Вам ведь не однократно посмотреть? Серию сывороток?

И зачем определять общие липиды, если все их фракции Вы и так планируете посмотреть?

Насчет сиаловых кислот и фосфолипидов не могу сказать. Наверняка тоже есть простые методики для клинико-диагностических лабораторий

[vagus]

Что-то у Вас методы по ТАГ и ХС древние. Для сыворотки давно созданы приличные наборы реактивов с ферментативным определением искомого вещества. Они просты, точны и по-моему не дорогие. Как пример, не сочтите за рекламу, наборы от "Вектор-Бест" в Новосибирске. Есть и другие подобные.

Вам ведь не однократно посмотреть? Серию сывороток?

И зачем определять общие липиды, если все их фракции Вы и так планируете посмотреть?

Насчет сиаловых кислот и фосфолипидов не могу сказать. Наверняка тоже есть простые методики для клинико-диагностических лабораторий

В том то и дело, сыворотки много -- у меня банально не хватит на всё стипендии, тем более будут и другие исследования. Может в России наборы стоят на много дешевле, не знаю... Но все же хотелось бы не сильно тратится. Зачем например покупать новый набор если у меня 4и уже есть, но нет триолеина, вот и надеялся его заменить маслом. Остальные вопросы тоже сформулированы исходя с определенных соображений. Возможно где то использовать старую методику, а если можно то еще и применить какой то новый подход. У меня просто мало опыта в этих вопросах, поэтому надеюсь на подсказки. А то проконсультироваться особо не с кем.

Изменено 7 Октября, 2011 в 20:02 пользователем vagus

[chemist-sib]

Возможно, будет полезной следующая информация (Биохимические методы исследования в клинике (справочник)/Под ред.А.А.Покровского.-М.,1969.-С.298) - в главе "Определение эфирносвязанных жирных кислот в сыворотке крови (по Ферхайдену и Нису в модификации И.Горанова и И.Апостолова)" :

...Стандартный раствор триолеина. 800 мг очищенного оливкового масла или триолеина растворяют в 100 мл чистого изопропилового спирта. Этот раствор годен в холодильнике в течение до 3 месяцев.

Метод очистки оливкового масла для приготовления стандартного раствора Ферхайдена и Ниса включает стандартизование с обычным сырым молоком, содержание жиров в котором определяют с помощью центрифуги Гербера с точностью до 50 мг%. Для более точного стандартизования используют оливковое масло, состав которого хорошо изучен и весьма постоянен.

Так как жидкие масла гидролизуются при комнатной температуре и выделяют свободные жирные кислоты, то необходима предварительная очистка оливкового масла от этих кислот. Оливковое масло растворяют в минимальном количестве перегнанного этилового эфира и наливают в делительную воронку. Имеющиеся свододные жирные кислоты нейтрализуют избыточным количеством 5% водного раствора карбоната натрия в присутствии индикатора фенолфталеина. Эфирную фракцию отделяют и избыток щелочи нейрализуют 1 н раствором соляной кислоты в присутствии индикатора конгорот. Эфирная фракция обезвоживается многократным фильтрованием через безводный сульфат натрия, а затем перегоняется в присутствии безводного сульфта натрия до полного удаления следов эфира. При правильном хранении очищенного оливкового масла в морозильнике обычного холодильника спонтанное образование в нем свободных жирных кислот незначительно.

 

Сразу честно говорю, что не понял про необходимость (или только возможность?) стандартизовать оливковое масло по молоку. Но вполне понятно, что чистое оливковое масло вполне пригодно в качестве стандарта вместо триолеина. Причем - ИМХО! - можно как самостоятельно почистить продающееся масло, так и воспользоваться максимально свежим "холодного отжима".

Успехов!

Изменено 11 Октября, 2011 в 08:38 пользователем chemist-sib

[vagus]

chemist-sib спасибо. Это мне и надо. Еще бы где справочник скачать -- А.А.Покровского. Как я понял там есть еще много полезного. Но пока не нашел. Смотрел оливковое масло, но там какой то осадок, наверно таки прийдется чистить. Жаль не нашел рафинированного оливкового. А подсолнечное рафинированное наверно не подойдет, т.к. там возможно эфиры др. кислот, а не только олеиновой. Но все равно как вариант купить оливковое и очистить по описанной методике.

Изменено 14 Октября, 2011 в 18:39 пользователем vagus

[chemist-sib]

...Еще бы где справочник скачать -- А.А.Покровского. Как я понял там есть еще много полезного. Но пока не нашел...

Про скачать - ничего не скажу, у меня на работе - обычнй бумажный вариант, его и смотрел. Но попробуйте "живьем" походить по клинико-диагностическим (биохимическим) лабораториям ближайших медицинских учреждений - думаю, не только Покровского, но и много чего другого интересного встретите, заодно и с коллегами пообщаетесь. Удачи!

[vagus]

совет конечно дельный, но как то ходить по лабораториям, я пока к этому еще не готов... на форуме удобней спрашивать, а так куда то ехать, да и скажут -- кто ты такой... , а здесь когда время есть тогда и отвечают, да и как то на форуме более дружественно все это происходит, другой этикет и принципиально другой способ общения.

Как вариант может пойду в библиотеку если найду там эту книгу то от-сканирую, и выложу. Подскажите пожалуйста если еще какие подобные книги знаете?

[chemist-sib]

Про книги о липидологии - взгляну на работе завтра; правда, пособия и руководства - старые, но в старых все как-то "приземленнее" объяснялось. А насчет боязни общения - ИМХО, конечно - но зря вы так. Когда-то ведь надо переходить от секса по телефону виртуального общения к общению "живому". Попробуйте просто прийти к зав. лабораторией и сказать: "Я - ваш коллега (или будущий коллега), можно проконсультироваться по поводу методик определения липидов?..". Поверьте - дальше края земли не пошлют, диплом не отберут, а остальное - не страшно. Я тоже не отношу себя к очень общительным или смелым в этом плане людям, но даже находять в больницах или санаториях в качестве пациента, не упускал возможности "напроситься в гости", поболтать на околопрофессиональные и пограничные темы (поскольку клиническая лабораторная диагностика, все-таки, не моя специальность). Да и к нам пришедших с подобными целями мы тоже не кусаем.

[chemist-sib]

Еще одна книга (Каракашов Ат., Вичев Ев. Микрометоды в клинической лаборатории. Пер. с болг.-София, 1968.-С.133), где в в главе "Определение общих жиров в 0,1 мл сыворотки крови" есть интересная информация по градуировке:

Стандартную кривую в случае отсутствия качественного триолеина строят при помощи чистого оливкового масла, содержащего около 84% триолеина (около 10% трипальмитина, 5-8% тристеарина). Если работа проводится с оливковым маслом, при построении кривой отсчитанные экстинкии умножают на 1,13.

Калибровочную кривую можно использовать и для работы с сывороткой крови, прием отсчитанные исправленные экстинкции умножают на эмпирически установленный коэффициент 0,76.

 

Еще один солидный (со множеством ссылок), но очень старый, труд - Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. Пер. с болг.-София, 1968. Достаточно хороший обзор старых методов, используемых в липидологии.

 

Чуть поновее - Колб В.Г., Камышников В.С. Клиническая биохимия (пособие для врачей-лаборантов). Минск: Изд. Беларусь, 1976.

Из предпоследних - думаю, что-нибудь интересное там найдется - Энциклопедия клинических лабораторных тестов (под ред. Н.Тица. М.: Лабинформ, 1997.

 

Успехов!

[vagus]

chemist-sib спасибо за информацию по поводу книг, да и за отзывчивость. Интересно еще деление липидов на фракции. Тоже еще не все понял. Но хотелось бы чтоб не набивать шишки все взвесить. Может кто то проводил и те и те методики. Какие лучше? А то с одной стороны делить их на фракции (кажется по типу электрофореза) в геле с одной стороны лучше -- не нужны дорогие реактивы, и быстрее -- можно прогнать все сразу, а потом смотреть. Но с другой стороны, это нужен опять же специальный прибор (которого естественно нет), гель, еще и какие то "свидетели", и др нюансы. Хотя я еще боюсь что разморожу сыворотку и нужно будет её про-исследовать, замораживать её опять не хочется, кстати это еще один с вопросов, как заморозка влияет на липиды? А то у меня в одной с инструкций написано что (если не ошибаюсь триацилглицериды) можно держать замороженными только 6 месяцев. Не ужели в замороженном состоянии идут какие то хим реакции тем более с жирами?

Изменено 17 Октября, 2011 в 15:19 пользователем vagus