Реакция EDC и NHS друг с другом в воде без присутствия карбоновой кислоты

[Loiso Pondohva]

В 26.06.2025 в 22:22, ash111 сказал:

просто переподзавывернуть

Конечно важна
Но инсулин - благо, белок хоть и глобулярный, но не особенно большой+дисульфидные мостики храни и сохрани.
Разберётся как-нибудь как ему зафолдиться и свернуться 🙄
Тож думал в сторону ДМСО. 

О, момент

Изменено 26 Июня, 2025 в 20:35 пользователем Loiso Pondohva

[Loiso Pondohva]

Блин. У меня все молекулярные пакеты остались на Линуксовом компе.
А WSL чёт подтупливает.
Не хочу сейчас с виртуалкой возиться
Но пакет GROMACS + VMD для визуализации дадут и расчёт энергий и модельку. Там вроде можно задавать кастомные растворители. 

В общем волшебником я сегодня не побуду(

[Miriada]

В 27.06.2025 в 04:53, ash111 сказал:

мне кажется таки надо менять метод, не?🤭

И спрашивать изобретателя, как он изобрел то что в реальности нифига не работает)

Спасибо за Ваше участие!

Дело в том, что ситуация неоднозначная и, возможно, даже абсурдная. 

Методика была опубликована в Nature Nanotechnology, была запатентована, и самое главное - это то, что получаемый таким образом композит демонстрирует удивительную биологическую активность, этот инсулин не разрушается в желудке и направляется именно в печень (куда и нужно) и делает свое дело.  

В связи с этим мне нельзя ни в коем случае менять эту методику. 

Когда методика дошла до меня и моих коллег, мы начали как следует анализировать этот композит, был разработан RP-HPLC-UV метод, чтобы сделать количественное определение инсулина в этом продукте. И это был первый раз, когда две побочные модификации инсулина были зафиксированы, то есть до этого никто об этом и не знал. 

Моя задача - просто уменьшить их количество, практически не меняя ничего, количества NHS и EDC могут быть изменены любым образом, они не фиксированы в патенте. К тому же я выявила, что именно EDC приводит к этим побочным модификациям. 

Изменено 27 Июня, 2025 в 03:05 пользователем Miriada

[Miriada]

Я провела некоторые контрольные эксперименты, варьируя мельчайшие детали, но даже это приводит к видимым изменениям. 

Вот так выглядит хроматограмма реакционной смеси до диализа, если я следую стандартной методике

Чистый инсулин около 9 мин
Побочная фракция инсулина с EDC # 1 около 3 мин
Побочная фракция инсулина с EDC # 2 около 4 мин
Между сигналами этих двух побочных продуктов - пик внутреннего стандарта



И я уверена, что никакого инсулина, привязанного к квантовым точкам, мы здесь не видим. 

А это - та же самая реакция, но без добавления квантовых точек. 


 

Изменено 26 Июня, 2025 в 23:51 пользователем Miriada

[ash111]

В 27.06.2025 в 02:24, Miriada сказал:

Моя задача - просто уменьшить их количество, практически не меняя ничего, количества NHS и EDC могут быть изменены любым образом, они не фиксированы в патенте.

просто уменьшая количество, разве вы не уменьшите число молекул инсулина, привязанных к квантовой точке? или это не имеет особого значения?

В 27.06.2025 в 02:44, Miriada сказал:

И я уверена, что никакого инсулина, привязанного к квантовым точкам, мы здесь не видим. 

А это - та же самая реакция, но без добавления квантовых точек. 

один в один)

[Miriada]

В 27.06.2025 в 09:45, ash111 сказал:

просто уменьшая количество, разве вы не уменьшите число молекул инсулина, привязанных к квантовой точке? или это не имеет особого значения?

Учитывая, что результаты с квантовыми точками и без них одинаковы, что указывет на то, что амидная связь не образуется, полагаю, это не должно сказаться 

[Loiso Pondohva]

В 27.06.2025 в 01:24, Miriada сказал:

Методика была опубликована в Nature Nanotechnology, была запатентована, и самое главное - это то, что получаемый таким образом композит демонстрирует удивительную биологическую активность, этот инсулин не разрушается в желудке и направляется именно в печень (куда и нужно) и делает свое дело.  До настоящего момента положительные результаты получены на диабетических мышах, крысах и бабуинах. 

Nature Nanotech - это классно, но подозрительная селективность для не-таргетного квантум дота хочу я вам сказать)
(Или инсулин на поверхности как-то выступает и в роли рецептора для связывания??)
Можно doi для себя? Интересно, как они следили за её биологическим путём и концентрациями и как оно так метко залетело в воротную вену. 

 

В 27.06.2025 в 01:24, Miriada сказал:

на диабетических мышах, крысах и бабуинах. 

Хотя мне как-то симпатичнее история с пролиферацией бета-клеток через  DYRK1A гармином, чем бесконечная история с инсулином.
 

В 27.06.2025 в 01:24, Miriada сказал:

Мое мнение- вещество, должно быть, и хорошее, раз работает, но недоисследованное, и вероятно, не то, чем кажется (реальная структура отличается от той, что была представлена в Nature).

А вот это, кстати - запросто. Там этих модификатов инсулина и инсулиноподобных белков которые могут быть сильно эффективнее исходного человеческого инсулина или иметь неожиданные функции - пруд пруди. Да и устойчивость к гидролизу в жкт - не самая удивительная для небольших белков вещь.
Может как раз кривой методикой попали точно в цель, и сами квантовые точки там вообще вещь вторичная? 

Изменено 26 Июня, 2025 в 23:58 пользователем Loiso Pondohva

[Loiso Pondohva]

А всё я уже нашёл!

[Miriada]

В 27.06.2025 в 02:44, Miriada сказал:

Я провела некоторые контрольные эксперименты, варьируя мельчайшие детали, но даже это приводит к видимым изменениям. 

Вот такие интересные данные.
Главные закономерности:
 - мы не наблюдаем занчимой разницы в опытах без квантовых точек и с ними

- две побочные фракции инсулина появляются из-за модификаций, вызванных EDC (причем в опыте со стандартными условиями и в опыте с одним EDC мы видио одинаковое количество чистого инсулина) - кстати, я думаю, что этот чистый инсулин и определяют биологическую активность, хотя побочные пролукты тоже могут сохранять активность, есл модификации незначительны)
- модификация инсулина происходит моментально, в момент его добавления
- если добавлять инсулин к активированному раствору быстрее, то это помогает уменьшить концентрациии побочных инсулиновых фракций, и увеличить концентрацию чистого инсулина
- если на стадии активации добавлять NHS первым, то это тоже каким-то образом помогает уменьшить побочные фракции инсулина 

 

Изменено 28 Июня, 2025 в 06:47 пользователем Nil admirari

[Loiso Pondohva]

В общем в статье всё довольно весело)

"Высокие дозы перорального инсулина (до 300 IU/kg) не вызывали гипогликемию" (а это эквивалент 30IU подкожно по их же заявленной методике).
Но при этом они утверждают что у них - высокая биодоступность.
Странновато но ок.

Авторы лишь предполагают, что наночастицы поглощаются гепатоцитами in vitro, но in vivo это не подтверждено (хотя механизм через pH - очень элегантный нарисован, если он реально будет работать).
Прямых док-в что частицы поглощаются энтероцитами и идут в портальную вену-нема (а такое в принципе можно визуализировать через ПЭТ) - нема

Самое важное.
У них там С14 меченый инсулин из которого они выводят биодоступность по конц. в крови
Но их текста нифига не ясно они измеряли...Что? Интактный инсулин, метаболиты? Как в итоге выглядела эта молекула с С14 и почему они решили что она инсулином осталась.

0 данных по анализу связывания вещества с рецептором в печени, все выводы делаются по количеству жира и прочей "клинике".

Гистология вроде ок. Только чё n=3, ну это несерьёзно...

Имуногистохимии нет, вестерн блота нет, данных по фосфорилированию рецептора инсулина нет...полный разброд...

А ЕЩЁ АААА
C. elegans - как модель ПЕРОРАЛЬНОЙ ДОСТАВКИ (у нематод печени нет, напомню. Как и много чего ещё. А ещё у червей слегка другие взаимоотношения с инсулиноподобными белками в целом...)
Бабуины - не диабетические. У них просто глюкозку смотрели...

Может быть я очень очень предвзят в данный момент, но чёт suspicious это всё. Может уже загоняюсь.
Но если оно работает (тут не буду вредным критиком, глюкозу здоровым бабуинам оно вроде как с p<0.05 снижало)
То у них в пробирке может быть один механизм с таким подходом, а на практике - вообще другой. 

В пробирке где у них "худо бедно QD склеены с инсулином" они наблюдают своё селективное поглощение QD и энзимозависимое освобождение инсулина
А in vivo у них могли получиться отдельно QD и отдельно ваши фракции с EDC, которые сохранив афинность к IR, и получив большую устойчивость в протеазам, в количестве где-то 3-5% смогли протопать в тушку. 

 

Изменено 27 Июня, 2025 в 00:29 пользователем Loiso Pondohva