Форумцы против короны!

[бродяга_]

Фуллерен C ₆₀ против коронавируса SARS-CoV-2: взгляд in silico

Скрытый текст

Согласно отчетам ВОЗ, новый коронавирус SARS-CoV-2 в настоящее время широко распространен во всем мире. На данный момент подтверждено более 162 миллионов случаев заболевания, в том числе более 3 миллионов случаев смерти. Из-за того, что пандемия все еще распространяется по миру, необходимо создание вычислительных методов для поиска новых потенциальных механизмов подавления вирусов. В соответствии с тем фактом, что фуллерен C ₆₀ (сферическая молекула, состоящая из углерода) проявляет ингибирующую активность в отношении различных белковых мишеней, здесь был проведен анализ потенциального механизма связывания между белками 3CLpro и RdRp SARS-CoV-2 с фуллереном C _60. сделано; это привело к одному и двум возможным механизмам связывания соответственно. В случае 3CLpro, C ₆₀фуллерен взаимодействует в кармане каталитического связывания. А для RdRp в первой модели фуллерен C ₆₀ блокирует поры синтеза РНК, а во второй - препятствует связыванию с кофактором Nsp8 (без этого комплексообразования RdRp не может выполнять свои исходные функции). Затем молекулярно-динамическое моделирование подтвердило стабильность созданных комплексов. Полученные результаты могут быть основой для других вычислительных исследований способов ингибирования 3CLPro и RdRp, а также возможности использования фуллерена C ₆₀ в борьбе с заболеванием COVID-19.

Вступление

Широко распространены вирусные инфекции; они составляют 95% всех известных инфекционных заболеваний человека. Коронавирусы - это одноцепочечные РНК-вирусы, поражающие позвоночных. С появлением SARS-CoV-2 (тяжелый острый респираторный синдром-коронавирус-2) сейчас стало немного коронавирусов, которые, как известно, заражают людей. До COVID-19 только SARS-CoV (обслуживает острый респираторный синдром-CoV) и MERS-CoV (ближневосточный респираторный синдром-CoV) вызывали заболевания ^{1 , 2 , 3 , 4} . Таким образом, открытие антикоронавирусных препаратов потребовало небольших усилий по сравнению с другими вирусными заболеваниями, такими как грипп. Учитывая быстрое распространение COVID-19 и его относительно высокую смертность, необходимо срочно восполнить пробел в лекарствах от коронавируса.

Геном SARS-CoV-2 включает 11 ORF (открытые рамки считывания). На 5'-конце ORF1a / b кодирует полипротеин 1a и 1b, который может быть расщеплен на 16 различных белков; например, PLpro (папаин-подобная протеаза), 3CLpro (химотрипсин-подобная протеаза) / Mpro (основная протеиназа), Nsp9 (неструктурный белок 9), связывающий белок, RdRp (РНК-зависимая РНК-полимераза), РНК-геликаза, экзо-рибонуклеаза, эндо-рибонуклеаза ^{5 , 6 , 7 , 8} . Напротив, белки, кодируемые с 3'-конца, такие как S-гликопротеин, нуклеокапсидный белок и другие ⁹. Итак, согласно вышеизложенному, неудивительно, что жизненный цикл коронавируса включает ряд потенциально достижимых этапов, включая проникновение эндоцитов в клетки-хозяева (ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2) и трансмембранная протеаза серин 2 (TMPRSS2)), РНК репликация и транскрипция (геликаза и РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp)), трансляция и протеолитический процессинг вирусных белков (3CLpro и PLpro), сборка вирионов и выпуск новых вирусов через экзоцитарные системы ¹⁰ .

Среди различных вирусных белков немногие являются незаменимыми для жизненного цикла вируса. 3CLpro белок играет решающую роль в репликации и экспрессии вирусных генов ^{11 , 12} . Активный центр этого белка содержит каталитическую диаду, где His 41 действует как основное кислотно-основное действие, а Cys 145 действует как нуклеофил. RdRp в комплексе с эфирными кофакторов Nsp7 и Nsp8 имеет важное значение для репликации РНК вируса ^{13 , 14} . На основании последних исследований, RdRp необходимо создать комплекс с Nsp7 и Nsp8, такая ассоциация активирует возможность репликации молекулы РНК длиной ^{14 , 15} . Таким образом, 3CLpro и RdRp, по-видимому, являются многообещающими белками-мишенями для разработки ингибиторов для лечения SARS-Cov-2.^{4 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22} .

Появление коронавируса SARS-CoV-2 с его реальной угрозой для жизни человека требует быстрой разработки инновационных диагностических тестов и противовирусных препаратов. В этом отношении нанобиоматериалы представляют собой альтернативный ресурс для борьбы с коронавирусами на разных стадиях инфекции путем избирательного действия ^{23 , 24} . Основной интерес к наносистемам на основе углерода заключается именно в их потенциальной низкой токсичности ^{25 , 26} и специфических механизмах ингибирования вирусов ²⁷ . Одним из перспективных кандидатов углерода противовирусной nanoformulation может быть C ₆₀ фуллерен ^{27 , 28} . Высокосимметричная наноструктура, такая как C ₆₀фуллерен имеет необычайное

геометрическое сходство с икосаэдрическими вирусами ²⁹ . Создание нанобиоматериалов в том же масштабе и с аналогичной геометрией - увлекательная возможность, которую можно использовать для стимулирования взаимодействий и создания интеллектуальных наноструктур для подавления или инактивации репликации вирусов. Хотя чистый фуллерен C ₆₀ имеет очень низкую растворимость в воде, он может образовывать стабильный коллоидный раствор ³⁰ , содержащий как отдельные молекулы C ₆₀ (0,72 нм), так и их сферические агрегаты, размер которых сопоставим со средним размером частиц SARS-CoV-2 - диаметр около 120 нм ³¹ . Механизм C ₆₀Диспергирование фуллерена в водных растворах может быть объяснено образованием ковалентной связи между гидроксилами и атомами углерода в клетке молекулы C ₆₀ в результате ультразвуковой обработки, которая приводит к последующему легкому растворению фуллерена C ₆₀ ³² . Благодаря гидрофобности фуллерен C ₆₀ легко проникает через биологическую мембрану путем пассивной диффузии или эндоцитоза ^{33 , 34} . Фуллерен C ₆₀ служит ингибитором ферментов, вектором доставки лекарств, контрастным агентом для МРТ и фотодинамической терапии ^{33 , 35 , 36 , 37}. Благодаря наличию в структуре двойных электронодефицитных химических связей фуллерен C ₆₀ легко присоединяет свободные радикалы, т.е. является мощным антиоксидантом ^{38 , 39 , 40} , способным эффективно проявлять противовоспалительное, антибактериальное, противоопухолевое, нейро- и радиозащитные эффекты в системах in vitro и in vivo ^{35 , 36 , 41 , 42} . Наконец, что важно, фуллерены C ₆₀ и их водорастворимые производные проявляют замечательную противовирусную активность ^{27 , 28 , 35 , 36} .

Таким образом, в данной работе мы впервые проанализировали доступные структуры 3CLpro и RdRp и их возможность взаимодействия с фуллереном C _{60 с} использованием вычислительных методов. Для этого фуллерен C ₆₀ доктировали в 3CLpro и RdRp согласно полученным моделям связывания (в случае 3CLpro это блокирование каталитической диады, в случае RdRp - блокирование поры синтеза РНК и предотвращение связывания с Nsp8). Затем было проведено молекулярно-динамическое (МД) моделирование полученного “C ₆₀комплексы фуллерен-3CLpro или RdRp ». Впоследствии полученные МД траектории были предметом анализа свободной энергии MMPBSA (молекулярно-механическая площадь поверхности Пуассона – Больцмана), а также MMGBSA (молекулярно-механическая обобщенная площадь поверхности Борна). Мы полагаем, что результаты наших расчетов проливают свет на возможные пути ингибирования 3CLpro и RdRp нанобиоматериалами, раскрывают основные свойства гибкости исследуемых мишеней и указывают на благоприятные и неблагоприятные аминокислоты для взаимодействия в выбранных связывающих карманах.

Методы расчета

Построение систем «C ₆₀ фуллерен-3CLpro или RdRp»

Согласно имеющимся структурным данным ^{43 , 44} , рентгеновские структуры мономерного белка 3CLpro (Protein Data Bank (PDB) ID 6M2N) ⁴⁵ и белка RdRp (PDB ID 7BV2) ⁴⁴ были извлечены из RCSB PDB ⁴² . Во-первых, из структуры белка были удалены все обычные молекулы воды и нативные лиганды. Затем перед выявлением связывающих карманов была проведена обработка структуры белка путем добавления недостающего водорода, корректировки состояний протонирования амидов, восстановления боковых цепей и, в конце концов, минимизации энергии. Для моделирования молекулярного докинга возможные карманы связывания для фуллерена C ₆₀ были определены с помощью вычислительного алгоритма полости в программе Caver ^46.и на основе анализа литературы ^{14 , 21 , 45 , 47 , 48 , 49 , 50} . В результате были идентифицированы три и один возможные карманы связывания для RdRp и 3CLpro соответственно.

К каждой целевой молекулярной стыковке проводили с использованием гибкой молекулы фуллерена C ₆₀ и жесткой молекулы 3CLpro или RdRp. Использован алгоритм систематической стыковки (SDOCK +) ⁵¹ , реализованный в пакете QXP ⁵² (метод демонстрирует все возможные конформации исследуемых структур с минимальным значением RMSD (среднеквадратичное отклонение) ⁵¹ ). Максимальное количество стандартных шагов SDOCK было установлено равным 300, и 10 лучших комплексов на основе встроенной функции ⁵² оценки QXP были отобраны для анализа на следующих этапах исследования. Оптимальная структура исследуемого «С _60»Комплексы фуллерен — 3CLpro или RdRp ”определяли по следующим основным критериям: (1) площадь контактных поверхностей белка и лиганда; (2) расстояние между фуллереном 3CLpro или RdRp и C ₆₀ ; 3) энергетические характеристики связи в образующемся комплексе. В результате молекулярной стыковки к каждой исследуемой один (лучший) «C ₆₀ фуллерен-3CLpro или RdRp» комплекс был выбран.

Протокол моделирования МД

Для оценки стабильности и важнейших взаимодействий полученных комплексов после молекулярного докинга было проведено МД-моделирование. Расчеты проводились с использованием Gromacs ⁵³ 5.1.3 в силовом поле ⁵⁴ Charmm36. Все исследуемые 3CLpro или RdRp были протонированы в соответствии со встроенной функцией в Gromacs 5.1.3. Топология фуллерена C ₆₀ была создана SwissParam ^55.. Комплексы, полученные после молекулярного докинга, были использованы для МД-моделирования. Каждая система была помещена в центр периодического кубического ящика, который затем был заполнен молекулами воды TIP3P. Между ближайшим атомом комплекса и краем бокса для моделирования сохранялось минимальное расстояние 0,9 нм, чтобы комплекс мог полностью погрузиться в воду и свободно вращаться. Затем, чтобы нейтрализовать систему и имитировать клеточную среду (pH = 7), Na ⁺ и Cl ^-ионы были добавлены, чтобы довести ионную концентрацию до 150 мМ. Здесь молекулы растворителя заменяются одноатомными ионами случайным образом. Затем полученный комплекс был минимизирован по энергии, что также устраняло любые стерические столкновения. Система была ослаблена применением алгоритма наискорейшего спуска (максимальное количество шагов 50 000). Затем уравновешивание вычислялось в два этапа: сначала NVT выравнивалось при 100 пс, а второе выравнивание NPT составляло 1 нс. После этого мы запустили МД-моделирование в течение 50 нс.

Отметим, что для каждого исследуемого комплекса « фуллерен С ₆₀ — 3CLpro или RdRp» МД моделирование проводилось по 3 раза . Все расчеты проводились при температуре 300 К и постоянном атмосферном давлении.

Связывание расчетов свободной энергии

Энергии связи каждого комплекса рассчитывали с применением метода MMPBSA для g_mmpbsa toll ^{56 в} соответствии со следующим уравнением ^{57 , 58.}

 textG textbinding= textG textcomplex− left( textG textprotein+ textG textligand right),

 

где G _{комплекс} : полная свободная энергия комплекса «C ₆₀ фуллерен-3CLpro или RdRp», G _{белок / лиганд} : полная свободная энергия изолированного белка и лиганда в растворителе, соответственно. Затем каждый параметр оценивался следующим образом

Gx= Gmm− TΔS + Gsolvatation,Gmm= Ebonded+ Enonbonded,Gsolvatation= Gpolar+ Gnonpolar,

 

где х «С ₆₀ фуллерен-3CLpro или RdRp» комплекс или только отдельный белок или С ₆₀ фуллерена, G _мм -Средняя молекулярной механики потенциальной энергии в вакууме (включают в себя энергию связаны (Е _{связаны} ) и несвязанных (Е _{несвязанных}  = Е _{Ван дер Ваальса}  + E _elect , где E _{vdW - энергия} Ван-дер-Ваальса и E _{elect -} электростатическая энергия) взаимодействия и рассчитаны на основе параметров силового поля молекулярной механики) ^{59 , 60 , 61} , TΔS - энтропийный вклад в систему, _{сольватация} G- свободная энергия сольватации (энергия, необходимая для переноса растворенного вещества из вакуума в растворитель).

Итак, здесь уравнение Пуассона – Больцмана (PB) решено для оценки полярной энергии десольватации (G _{полярной} ) ⁶² . В расчетах ПБ размер сетки составлял 0,5 Å. Значение диэлектрической проницаемости растворителя и диэлектрической проницаемости растворенного вещества составляло 80 и 2 соответственно. Неполярный (G _{неполярный} ) вклад был получен на основе доступной для растворителя площади поверхности (SASA, Å ² )

Gnonpolar=γSASA+b,

 

где γ - поверхностное натяжение растворителя, b - параметр подгонки ⁶³ .

Методика Далее MMGBSA была использована , чтобы получить более точную картину «C ₆₀ фуллерена-3CLpro или RdRp» взаимодействия ^{64 , 65} . Основная идея MMGBSA - это оценка энергии связи между каждым остатком 3CLpro или RdRp и фуллереном C ₆₀ . Алгоритм метода MMGBSA такой же, как в MMPBSA и представлен выше. Все энергетические параметры рассчитывались с использованием всех снимков траектории МД-моделирования длительностью 50 нс.

Результат и обсуждение

Определение кармана для переплета

Согласно анализу поверхности 6M2N и имеющимся литературным данным ^{21 , 22 , 66 , 67 , 68} , был идентифицирован единственный связывающий карман, способный взаимодействовать с фуллереном C ₆₀ (рис.  1 ).

 

[бродяга_]

Скрытый текст

продолжение...

Это каталитический связывающий карман. Этот карман занимает объем 892 Å ³ и содержит аминокислоты (Met 165, Met 49, Tyr 54, Cys 44, His 41 и Cys 145), которые способны создавать стэкинг-взаимодействия с фуллереном C ₆₀ . Кроме того, принимая во внимание, что этот связывающий карман напрямую опосредует мутации различных Nsp ^{21 , 69 , 70} , которые имеют решающее значение для жизненного цикла вируса, это делает 3CLpro перспективной мишенью для разработки лекарств против SARS-CoV-2 ^{17 , 21 , 22} .

В результате поверхностного и литературного исследования RdRp были обнаружены три связывающих кармана. Хорошо известно, что RdRp играет ключевую роль в синтезе РНК SARS-CoV-2 ¹⁴ . На основании нашего результата были указаны две модели связывания фуллерена C ₆₀ и RdRp: модель 1 - связывание фуллерена C ₆₀ в канале синтеза РНК и модель 2 - одновременное связывание фуллерена C ₆₀ с карманами 2 и 3 (рис.  2 ). Итак, блокируя канал синтеза РНК, процедура синтеза РНК будет невозможна ^{19 , 21 , 71} . Именно поэтому первый обнаруженный связывающий карман находит в РНК синтеза канала (рис.  2). С другой стороны, без помощи Nsp7 и Nsp8 как кофакторов RdRp не способен выполнять свои начальные функции ^{14 , 72 , 73} . На основании этих двух других карманов были обнаружены в интерфейсе связывания RdRp-Nsp8 (рис.  2 ). Все найденные связывающие карманы содержат по крайней мере две аминокислоты, которые могут создавать любые стэкинг-взаимодействия с фуллереном C ₆₀ . Например, карман 1 содержит Arg 570, Lys 578 и Tyr 690.

Молекулярный док

3CLpro в представленной модели связывания фуллерен C ₆₀ плотно застрял в каталитическом связывающем кармане. Это приводит к экранированию каталитической диады от взаимодействия с любыми другими молекулярными структурами. Здесь фуллерен C ₆₀ лежит над каталитическим His 41 и создает с ним прямое стэкинг-взаимодействие. Более того, в этой части каталитического связывающего кармана 3CLpro фуллерен C ₆₀ создает стэкинг-взаимодействие с Cys 145, Met 49, Met 165, Met 49 и стерические взаимодействия с Gln 189 и Asn 142 (рис.  3 A). Что еще более важно, эти аминокислоты расположены по разные стороны от кармана каталитического связывания и, как результат, они зажимают фуллерен C ₆₀ в кармане каталитического связывания.

RdRp, как и в случае с 3CLpro, фуллерен C ₆₀ заполняет выбранные связывающие карманы RdRp и плотно зажимается там посредством различных стэков и стерических взаимодействий (рис.  4 A, C, E). Ингибирование кармана 1 могло вызвать блокировку канала синтеза РНК (рис. 2 , 4 А). Здесь фуллерен C ₆₀ идеально подходит к связывающему карману и осуществляет взаимодействия π-катиона с Arg 570 и Lys 578, T-стекинг с Tyr 690 и стерические взаимодействия с Asn 497 и Leu 577. И наоборот, взаимодействие фуллерена C ₆₀ с карманом 2 или 3 изображена модель, которая предотвращает образование комплекса между RdRp и Nsp8 (рис. 2 , 4C, E). В результате RdRp не может выполнять свои первоначальные функции. Таким образом, в кармане 2 нижняя часть фуллерена C ₆₀ укладывается между Trp 510, Phe 369 и Leu 372, Leu 515 путем укладки и стерических взаимодействий соответственно. Кроме того, Tyr 516 и Phe 507 расположены на дне связующего кармана (рис.  4 C). Эти две аминокислоты, возможно, способны удерживать фуллерен C ₆₀ в текущем положении за счет взаимодействия стэкинга. Несмотря на вышесказанное, стабильность полученного комплекса вызывает сомнения, поскольку сам связывающий карман неглубокий. Из-за такой плоской геометрии поверхности кармана 2 C ₆₀фуллерен мог быть вытеснен из этого связующего кармана. Несмотря на то, что в кармане 3 почти нет какой-либо ароматической аминокислоты, которая способна создавать стэкинг-взаимодействия с фуллереном C ₆₀ , мы думаем, что карман 3 является многообещающим из-за его глубины. Здесь фуллерен C ₆₀ создает стерические взаимодействия с Ala 384, Val 331, Val 399, Thr 325 и Leu 271. Кроме того, связывающий карман содержит Phe 397 и Tyr 274, которые пространственно близки к пристыкованному фуллерену C ₆₀ . Таким образом, существует возможность стекового взаимодействия с этими аминокислотами.

Результаты молекулярного докинга предполагают, что во всех выбранных связывающих карманах фуллерен C ₆₀ способен создавать стабильный комплекс с мишенями 3Clpro и RdRp. Связывание с 3CLpro характеризуется одной возможной моделью связывания. Для RdRp были исследованы модель 1 (взаимодействие в кармане 1) и модель 2 (одновременное взаимодействие с карманами 2 и 3).

MD анализ

Для получения более точных результатов было проведено МД моделирование 50 нс (рис. 3 , 4 , 5 , 6 ). Полученные результаты показали , что MD каждый исследовал «C ₆₀ фуллерен-3CLpro или RdRp» являются стабильными. Движение RMSD при МД моделирования каждого комплекса находится в диапазоне 2–3 Å (рис.  5 ). Кроме того, в некоторых примерах фуллерен C ₆₀ способен образовывать новые и более выгодные взаимодействия.

Траектории RMSD комплексов 3CLpro ( A ) и RdRp ( B ) с фуллереном C ₆₀ : свободная белковая молекула 3CLpro - зеленый, комплекс «C ₆₀ фуллерен-3CLpro» - красный и свободная белковая молекула RdRp - зеленый, «C ₆₀ фуллерен-RdRp» Карман 1 (модель связывания 1) - красный, карман 2/3 « фуллерен C ₆₀ -RdRp» (модель связывания 2) - оранжевый.

RMSF 3CLpro ( A ) и RdRp ( B ) в комплексе с фуллереном C ₆₀ : свободная белковая молекула 3CLpro - зеленый, комплекс «C ₆₀ фуллерен-3CLpro» - красный и свободная белковая молекула RdRp - зеленый, «C ₆₀ фуллерен- Карман 1 RdRp (модель связывания 1) - красный, карман 2/3 " фуллерен C ₆₀ -RdRp" (модель связывания 2) - оранжевый.

Смоделированный комплекс 3CLpro показан на рис.  3 B. Для 3CLpro было обнаружено, что фуллерен C ₆₀ сдвигается на 3,2 Å и вызывает смещение Asn 142 на 4,8 Å в сторону фуллерена C ₆₀ . Напротив, фуллерен C ₆₀ вытеснил Gln 189 на 1,8 Å из каталитического связывающего кармана. Связывание с такими аминокислотами, как Met 156, Phe 181, His 164 и др., Не претерпевает каких-либо фундаментальных изменений. Более интригующим является то, что и His 41, и Cys 145 (каталитическая диада) также вытесняются из своего исходного положения фуллереном C ₆₀ . В результате нарушается целостность каталитической диады, что, несомненно, отрицательно сказывается на функциональности 3CLpro. Модель «C ₆₀Комплекс фуллерен-3CLpro ”был затем подвергнут исследованию RMSF (среднеквадратическое отклонение). Нет, никаких экстремальных колебаний по сравнению со свободной формой молекулы 3CLpro обнаружено не было (рис.  6 A). Например, гибкость His 41 в свободной форме и в связи с фуллереном C ₆₀ составляет 0,8 и 1,4 Å соответственно. Кроме того, в случае с «C ₆₀ фуллерена-3CLpro» комплекса, снижение значений флуктуации была определена.

RdRp согласно результату МД моделирования в случае карманов 1 и 2 наблюдались флуктуации фуллерена C ₆₀ внутри обоих связывающих карманов (4,1 Å и 3,5 Å соответственно) без значительных изменений в полученных комплексах (рис.  4 B, D). . Причем, в кармане 3 была обнаружена противоположная картина. Здесь фуллерен C ₆₀ погружен внутрь связующего кармана на 4,0 Å. Как бы то ни было, ключевые взаимодействия между фуллереном C ₆₀ и RdRp во всех моделях сохраняются (рис.  4).Б, Г, Е). Таким образом, почти никаких изменений не было обнаружено во время МД моделирования для кармана 1. Здесь можно сказать, что аминокислоты Ile 590, Tyr 690, Leu 577 и Gln 574 жесткие и лишь немного меняют свое исходное положение во время МД моделирования (< 0,75 Å) эти аминокислоты взаимодействуют с фуллереном C ₆₀ посредством сильных стерических взаимодействий. Напротив, Lys 578 и Arg 570 более гибкие и характеризуются некоторым смещением (1,5 Å и 1,6 Å соответственно). Интересно, что взаимодействие π-катиона с Lys 578 нестабильно, но с Arg 570 стабильно. Arg 570 тесно связан с фуллереном C ₆₀ . Такая разница во взаимодействиях между C ₆₀фуллерен и Lys 578 / Arg 570 могут быть связаны с расположением этих аминокислот в связывающем кармане. Lys 578 располагается на краю кармана и может свободно перемещаться (особенно из-за длинного линкера аминокислоты Lys), в отличие от Arg 570, который располагается внутри кармана связывания и имеет меньше места для движения. В кармане 2 (рис.  4 E) фуллерен C ₆₀ застрял в инсайт-кармане, создавая стерическое взаимодействие с Leu 372, Leu 515 и складываясь с Phe 369 и Trp 510. Примечательно, что во время всей траектории МД-моделирования смещение ключевые связывающие аминокислоты (например, Phe 369, Trp 510, Tyr 516, Leu 315 и Leu 367) минимальны, около 1 Å. Также мы думаем, что в этой позиции C ₆₀фуллерен удерживается стэкинг-взаимодействием с Tyr 516, который располагается на дне связывающего кармана 2. Таким образом, расстояние между фуллереном C ₆₀ и Tyr 516 составляет около 3 Å во время всего МД-моделирования. Наконец, в кармане 3 наблюдалась перевернутая картина по сравнению с приведенной выше (рис.  4 F). С ₆₀фуллерен смещается внутри связывающего кармана и плотно укладывается среди окружающих гидрофобных аминокислот за счет взаимодействия с RdRp посредством стэкинга и стерических взаимодействий с Phe 397 и Val 399, Ala 384, Val 331, Thr 325 соответственно. Эти взаимодействия становятся возможными благодаря сдвигу Phe 397 (4,9 Å), Val 399 (3,5 Å) и Ala 384 (3,2 Å). Остальные аминокислоты Val 331 и Thr 235, расположенные в кармане 3, практически не сдвинуты (около 0,5 Å). Что касается предыдущей цели, здесь также был проведен анализ RMSF (рис.  6 B). Таким образом, аминокислоты 324–342 и 364–410 в случае связывания фуллерена C ₆₀ в карманах 2 и 3 более гибкие по сравнению с моделью, где C ₆₀связь фуллерена с карманом 1 и несвязанным RdRp. Это неудивительно и может быть просто объяснено перемещением и погружением фуллерена C ₆₀ в связывающие карманы 2 и 3. Конечно, во время перемещения / погружения фуллерен C ₆₀ на некотором уровне выталкивает аминокислоты, и это приводит к их подвижности. Однако в модели с карманом 1 для связи фуллерена C ₆₀ наблюдается зеркальная ситуация. Здесь гибкость аминокислот 840–862 больше по сравнению с их гибкостью в случае несвязанного RdRp или связи с карманами 2 и 3. Такой результат был получен благодаря тому, что в случае связывания фуллерена C ₆₀ в кармане 1 молекула РНК отсутствует в поре синтеза РНК (не хватает места для молекулы РНК).

Подход MMPBSA

Потенциал аффинности связывания в рамках «C ₆₀ комплексов фуллерена-3CLpro или RDRP» были оценены с помощью анализа MMPBSA. Таблица 1 показывает , что G _{связывание} в «C ₆₀ фуллерен-3CLpro или RdRp кармана 3» комплексы являются более благоприятными по сравнению с «C ₆₀ фуллерен-RdRp кармана 1/2». Затем, для лучшего понимания того, какой тип энергии имеет больший вклад в образование и стабильность комплекса, был проанализирован каждый отдельный энергетический компонент. Из таблицы 1 _видно, что E _vdW имеет наибольший вклад в энергию связи фуллерена C ₆₀ с 3CLpro и RdRp. Как и ранее, значения E _vdW “CКомплексы ₆₀ фуллерен-3CLpro или RdRp pocket 3 ”намного лучше по сравнению с“ C ₆₀ фуллерен-RdRp pocket 1/2 ”. Другие рассчитанные энергии (E _elect , G _{полярная} и G _{неполярная} ) положительны или близки к нулю. Поэтому их влияние на комплексообразование и особенно на устойчивость неблагоприятно. Однако _{неполярные} вклады E _elect и G несколько лучше, чем G _{полярные} . В любом случае, этот немного больший эффект от E _elect и G _nonpolar не намного заметнее по сравнению с G _polar .

MMGBSA подход

Чтобы получить более точную характеристику энергии связи полученных комплексов, было проведено исследование разложения по свободной энергии остатков. Согласно результатам, представленным на рис.  7, наиболее благоприятный вклад во все модели вносят аминокислоты, которые способны создавать стэкинг-взаимодействие с фуллереном C ₆₀ . Однако обнаруживаются некоторые исключения (например, « фуллерен C ₆₀ -RdRp карман 1»).

3CLpro Рис.  7 A подчеркивает роль каталитической диады в процессе связывания. His 41 и Cys 145 положительно влияют на связывание с фуллереном C _60, а энергия связи составляет -4,63 и -3,88 кДж / моль соответственно. Как упоминалось выше, благодаря этому фуллерен C ₆₀ может погружаться в каталитический связывающий карман 3CLpro. Тем не менее, связывающий вклад каталитической диады не самый благоприятный. Аминокислоты Met 49 (энергия связи с фуллереном C ₆₀ - 5,54 кДж / моль), Met 165 (- 8,18 кДж / моль), Leu 50 (-3,99 кДж / моль), Gly 143 (- 2,58 кДж / моль), Asp 187 (- 2,83 кДж / моль) и Gln 189 (- 5,25 кДж / моль) зажимают фуллерен C ₆₀ в связывающем кармане за счет стэкинга и стерических взаимодействий (рис.3 Б, 7 А). Неожиданно, вопреки вышеизложенному, Arg 40 (6,94 кДж / моль) вызывает дестабилизацию образования комплекса « фуллерен C ₆₀ – 3CLpro». Это можно объяснить тем фактом, что фуллерен C ₆₀ предотвращает взаимодействие Arg 40 с молекулами воды, которых обычно много в любом связывающем кармане.

RdRp сравнение ключевых аминокислот в кармане 1 показало, что стерические взаимодействия с фуллереном C ₆₀ здесь наиболее благоприятны (рис.  7 B). Среди всего остатка взаимодействие между фуллереном C ₆₀ и Ile 49 (- 5,78 кДж / моль), Asn 497 (- 2,67 кДж / моль), Leu 557 (- 6,89 кДж / моль), Lys 578 (- 5,71 кДж / моль). ), Ala 581 (- 4,68 кДж / моль), Ile 590 (- 2,65 кДж / моль) и Gly 591 (- 2,89 кДж / моль) намного лучше по сравнению с другими аминокислотами в связывающем кармане 1. И что интересно, только один из них образует π-катионное взаимодействие (Lys 578) с фуллереном C ₆₀ . Потому что C ₆₀фуллерен представляет собой ароматическую систему и предпочтительно создает различные взаимодействия стэкинга, что может отрицательно сказаться на стабильности комплекса. Как и ранее, в связывающем кармане 1 фуллерен C ₆₀ дестабилизируют небольшое количество аминокислот , а именно: Arg 570 (2,31 кДж / моль) и Tyr 690 (1,25 кДж / моль). Для связывания в кармане 2 стэкинг взаимодействия являются благоприятными (фиг. 4 D, 7 C). Как следует из рис.  7 C, такие аминокислоты, как Leu 367 (- 2,16 кДж / моль), Phe 369 (- 8,64 кДж / моль), Leu 372 (- 5,58 кДж / моль), Leu 373 (- кДж / моль) , Phe 507 (- 1,51 кДж / моль), Tpr 510 (- 9,76 кДж / моль), Leu 515 (- 6,04 кДж / моль) и Tyr 516 (- 4,42 кДж / моль) создают сильное взаимодействие с C ₆₀фуллерен. В отличие от других исследованных связывающих карманов, в этом случае ни одна аминокислота не оказывает сильного неблагоприятного влияния на образование комплекса « фуллерен C ₆₀ – RdRp pocket 2». . Из рисунка  7 D можно видеть , что взаимодействие между С ₆₀ фуллерена и RdRp кармана 3 в основном определяется следующими остатками Ser 326 (- 1,53 кДж / моль), Thr 325 (- 1,95 кДж / моль), Pro 329 ( - 2,14 кДж / моль), Val 331 (- 5,42 кДж / моль), Pro 379 (- 3,64 кДж / моль), Ala 380 (- 4,98 кДж / моль), Ala 383 (- 3,48 кДж / моль), Leu 388 ( - 1,88 кДж / моль), Phe 397 (- 5,73 кДж / моль), Val 399 (- 5,04 кДж / моль), Met 667 (- 4,86 кДж / моль) и Val 676 (- 3,86 кДж / моль). Здесь мы можем наблюдать сочетание благоприятных стерических и стэкинг-взаимодействий между C ₆₀фуллерен и карман 3. Например, наиболее сильно фуллерен C ₆₀ взаимодействует с Vall 331, Ala 380, Val 339 и Val 676 посредством стерических взаимодействий и, несмотря на вышеизложенное, посредством взаимодействия стэкинга с Pro 379, Phe 397 и Met 667. И, наконец, в этом случае взаимодействие фуллерена C ₆₀ с Phe 327 неблагоприятно. Это может быть связано с тем, что только пептидный остов Phe 327 взаимодействует с фуллереном C ₆₀ . Кроме того, эта часть основной цепи фуллереном C ₆₀ изолирована от растворителя, что, возможно, способно вызвать такое напряжение между этими молекулярными частями / структурами.

Подводя итог, можно сказать, что подход in silico позволяет моделировать поведение фуллерена C ₆₀ в сайтах связывания коронавируса SARS-CoV-2 и, таким образом, прогнозировать терапевтический эффект этой уникальной молекулы. Дополнительное взаимодействие фуллерена C ₆₀ с белками лежит в основе его биомедицинских эффектов ^{74 , 75 , 76 , 77} . Итак, молекулярный докинг и моделирование MD были выполнены с использованием Toll-подобных рецепторов (TLR играют чрезвычайно важную роль в поддержании иммунного гомеостаза человеческого тела), включая TLR4 ⁷⁵ . Связывание C ₆₀фуллерен с TLR4 характеризуется полным заполнением гидрофобного кармана домена MD-2 и образованием значительного количества взаимодействий стэкинга (например, с Phe 119, Phe 76 и Phe 104). Такое изменение сайта связывания связано со значительной подвижностью взаимодействующих компонентов: значение RMSD для белка составляет 4,6 Å, а для фуллерена C ₆₀ - 5,3 Å. Полученный комплекс « фуллерен С ₆₀ -TLR4» характеризовался высокой энергией: - 50 кДж / моль. В недавнем исследовании ⁷⁸ было обнаружено, что спайковый белок SARS-CoV-2 взаимодействует с внеклеточным доменом TLR на поверхности клетки. Интересно, что самая высокая аффинность и сила связывания были очевидны в комплексе «спайковый белок-TLR4». Таким образом, использование C ₆₀ Фуллерен для ингибирования TLR4, а также активации 3CLpro и RdRp может быть эффективной стратегией лечения COVID-19.

Заключение

Компьютерное моделирование (стыковка и молекулярная динамика), которое мы представили здесь, предполагает, что фуллерен C ₆₀ способен блокировать 3CLpro (блокирование каталитической диады) и RdRp (блокирование модели 1 и 2) белковые мишени коронавируса SARS-CoV-2 с различными механизмами и подавляют его функциональную активность. Моделирование показало, что во всех исследованных комплексах фуллерен C ₆₀ заполняет связывающий карман и застревает в нем за счет стэкинга и стерических взаимодействий. Критично то, что для фуллерена 3CLpro C ₆₀ нарушается целостность каталитической диады. Все остальные изменения во время моделирования не были значительными. В случае карманов 1 и 2 RdRp, C ₆₀фуллерен просто колеблется внутри связывающих карманов без принципиальных изменений ранее полученных комплексов. Обратная картина наблюдается в кармане 3 RdRp, здесь фуллерен C ₆₀ погружается в карман связывания и застревает там. Исследование MMPBSA показало, что во всех случаях _{связывание} G более благоприятно в случае комплексов «C ₆₀ фуллерен-3CLpro или RdRp pocket 3» по сравнению с другими. И как главный компонент, E _vdW вносит наибольший вклад во все комплексы. Кроме того, вклад E _elect , G _{полярного} и G _{неполярного}сомнительны и, прежде всего, неблагоприятны из-за близости энергий к нулю или, в некоторых случаях, из-за того, что энергии намного больше нуля. И, наконец, на основе исследования MMGBSA были обнаружены благоприятные и неблагоприятные аминокислоты для образования комплексов с фуллереном C ₆₀ . Результаты исследования могут дать понимание связывания 3CLpro и RdRp с другими нанобиоматериалами. Более того, поскольку чистые фуллерены C ₆₀ могут образовывать высокостабильный водный коллоидный раствор и проявлять антикороновирусную активность, это расширяет их использование в профилактических и терапевтических целях, что требует дальнейшего тестирования in vitro и in vivo.

 

 

Изменено 13 Ноября, 2021 в 10:19 пользователем бродяга_

[mirs]

1 час назад, бродяга_ сказал:

на уровне, если таракану оторвать ноги, то он оглохнет.

В Вашей фразе - условное предложение. В моей фразе - два повествовательных предложения, одно из них с сослагательным наречием при глаголе. Вы сравниваете зеленое и квадратное.
И даже определяете уровень.

Изменено 13 Ноября, 2021 в 11:26 пользователем mirs

[бродяга_]

18 минут назад, mirs сказал:

В Вашей фразе

это из анекдота про Петьку и Василия Ивановича.

[mirs]

34 минуты назад, бродяга_ сказал:

это из анекдота про Петьку и Василия Ивановича.

Анекдот в студию.. Я Вам даже помогаю..

Изменено 13 Ноября, 2021 в 12:03 пользователем mirs

[Nemo_78]

9 часов назад, бродяга_ сказал:

учатся на ошибках. ошибаться три раза подряд сродни танцу чечетки на граблях.

   Это демагогия, уважаемый...           Троекратное повторение у Владимира Ильича - это только риторический приём для усиления эмоциональности призыва, а не указание на необходимость троекратного повторения одних и тех же действий ввиду непонятливости исполнителя.

    И снова, не поверю, что Вы этого не понимаете... Всё больше Вы, кмк, на скользкую химикуровскую провокационную тропку становитесь...

 

Изменено 13 Ноября, 2021 в 14:31 пользователем Nemo_78

[фосолиф-кимих]

3 часа назад, МВВ сказал:

Врач объяснил «утечку иммунитета» плохой ревакцинацией

Через три месяца после вакцинации от COVID-19 титр антител в организме человека падает в три раза, а через полгода — в 10 раз. Поэтому россияне, которые поставили себе прививку или переболели коронавирусом, должны пройти ревакцинацию. Об этом URA.RU рассказали иммунолог и кандидат медицинских наук Николай Крючков и научный руководитель Общества специалистов профилактической медицины, доктор медицинских наук Сергей Токарев.
Врач объяснил «утечку иммунитета» плохой ревакцинацией

По словам Крючкова, из-за низких темпов ревакцинации в России происходит приличная «утечка иммунитета». Специалист отмечает, что это серьезная проблема, и люди, переболевшие COVID-19 или поставившие себе прививку, должны получить новую дозу вакцины вовремя, чтобы сохранить уровень коллективного иммунитета.

Он отметил, что уровень антител в 300 Bau, по результатам исследований, обеспечит 80% защиты. Однако из-за нового штамма «Дельта» появилась необходимость в более высоком показателе.

Ранее директор Центра им. Гамалеи Александр Гинцбург заявил, что введение обязательных QR-кодов на транспорте, в кафе и магазинах, будет иметь смысл только в том случае, если эту меру выполнят полноценно, а граждане будут пользоваться только настоящими сертификатами о вакцинации. Однако в остальном он относится к этой инициативе положительно. Об этом сообщает "Рамблер". Далее: https://news.rambler.ru/community/47567431/?utm_content=news_media&utm_medium=read_more&utm_source=copylink
Шведские ученые выяснили, как вакцины от COVID-19 могут снижать иммунитет.
Белок SARS-CoV-2 не дает белкам организма восстанавливать поврежденные ДНК

http://doctorpiter.ru/articles/691383/

Как он мог упасть в три раза, если на момент вакцинации он и так около нулевой был?

С какого потолка взята цифра в 300 Bau/мл? Я на пап меде статьи смотрел. Фигурируют значения от 25 до 100 Bau/мл в качестве нижней границы защитного титра.

[бродяга_]

57 минут назад, Nemo_78 сказал:

на скользкую

это довольно твердая оценочная позиция, а вот все остальное...

 

 

58 минут назад, Nemo_78 сказал:

демагогия

 

есть настоящий реальный результат с демографией и есть поиск причины, все в цифрах, так сказать сухой остаток.

[mirs]

1 час назад, Nemo_78 сказал:

Это демагогия

Ну на самом деле оппонент не так уж и демагог. Просто оппонент не фиксирует мелкие детали, сознательно или по незнанию оных. Человечество учится на ошибках, большие группы людей (типо государства) учатся на ошибках. Но эта ошибка фиксируется и как бы не повторяется. Советский строй был ошибкой, национал-социализм, уничтожение воробьев в Китае, кролики в Австралии, камчатские крабы под Мурманском. Но это не значит, что каждый человек должен учиться на собственных ошибках, если про них все давно известно. Где ошибка  в реакции правительств и населения на корону - будет видно лет через 20. Хотя чума, оспа, холера, испанка должны были чему-то научить соответствующих лиц.

[бродяга_]

1 час назад, Nemo_78 сказал:

что Вы этого не понимаете...

понимаю как программу, которая до сих пор работает, потому как цена была уплачена высокая.